[发明专利]一种含有高分子透明质酸的生物滑液的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及润滑液领域，具体涉及一种新型医用生物滑液的制备方法

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid，HA)，又称玻璃酸，是Meyer和Palmer于1934 年最先从牛眼玻璃体中分离出来的一种高粘性物质。后来又有学者对HA的生理 功能、化学结构和临床上的应用进行了大量的研究。盐形式的HA可以包括透明 质酸钠、透明质酸钾、透明质酸镁、透明质酸钙或其他的透明质酸盐。

透明质酸是一种生物来源的粘多糖，在自然界分布广泛。已知的透明质酸存 在于各种动物组织中，例如脐带、滑液、玻璃体液、公鸡冠和各种结缔组织中。

人体中关节滑液是由关节滑膜细胞分泌，滑液覆盖在关节表面。HA是构成关 节软骨和滑液的主要成分。对关节生理功能的发挥起着至关重要的作用。在关节 中，关节盘、滑液、关节软骨均参与关节润滑，在生理负荷之下，滑液构成的液 膜在关节润滑中起主要作用，而在高负荷之下关节面之间可以发生接触，滑液构 成的边界润滑系统起主要作用。正常的关节软骨表面覆盖着很薄的表面活性磷脂 层，各个磷脂分子借助氢键相连形成了一层保护膜，在边界润滑中起主要作用。 高分子量的透明质酸作为一种液态薄膜与表面活性磷脂层相连，以保护其不受磷 脂酶A2的攻击，在边界润滑系统中起间接作用。另外，在滑液中还存在一种粘 性糖蛋白—润滑素，它被认为是表面活性磷脂的水溶性载体，是人类滑膜成纤维 细胞的巨核细胞刺激因子基因的表达产物，它和磷脂一起以脂蛋白的形式由滑膜 B型细胞分泌至滑液中，在磷脂从滑液沉积至关节软骨表面的过程中起到了载体 的作用。当发生骨性关节炎(OA)、类风湿性关节炎(RA)等其他感染性和非感 染性关节疾病时，HA在关节内的产生和代谢发生异常，滑液中HA的浓度和相对 分子质量(Mr)明显降低，软骨发生降解和破坏，导致关节生理障碍。应用透明 质酸进行关节病的关节腔内注射治疗，旨在通过补充外源性HA，恢复滑液的润 滑功能，促进软骨的修复，改善关节功能。

迄今为止，大量的临床研究使用结果表明，HA对OA、RA等关节疾病治疗效 果明确、安全，具有很好的临床应用前景。

目前，HA原料普遍采用的生产方法主要有两种：一种是从动物组织中提取； 另一种是微生物发酵法。提取法主要利用鸡冠、人脐带、牛眼的玻璃体等为原料， 进行生产，而且组织必须是新鲜采集，这样不但动物组织来源困难，且价格昂 贵，成本高，这给HA的生产带来了一定的困难；发酵法生产HA，是利用链球 菌将廉价的葡萄糖转化为HA，不依赖于动物器官，产量不受限制，但发酵法HA的 产量不高，生物相容性不如前者。本发明提供的通过细胞培养的方法提取透明质 酸的新方法，能够制备出具有更好的润滑功能、生物理化性能、生物安全性能的 含有高分子透明质酸的新型生物滑液。

发明内容

本发明的目的是针对传统的透明质酸的来源、成本、生物相容性、理化性能 等方面的不足而提出的一种新型含有高分子透明质酸的生物滑液的制备方法。该 方法的特点是通过培养动物或人的滑膜细胞、提取滑膜细胞分泌的透明质酸，经 过超滤后浓缩，制备成具有更好的润滑功能、生物理化性能、生物安全性能的含 有高分子透明质酸的新型生物滑液。

实现本发明目的的技术方案是：这种含有高分子透明质酸的生物滑液的制备 方法是首先培养动物或人的能够产生透明质酸的滑膜细胞，然后从培养液中提取 滑膜细胞分泌的高分子透明质酸，并将提取了高分子透明质酸后的培养液经过超 滤后浓缩得沉集物，将提取的高分子透明质酸与所得沉集物按药用量溶解于生理 盐水中即制得含有高分子透明质酸的生物滑液。

该方法包括如下具体步骤：

(1)培养动物或人的能够产生透明质酸的滑膜细胞：取需要量的滑膜组织， 用组织块法培养滑膜细胞，然后用单细胞克隆法对滑膜细胞进行分型，得单细胞 群体悬液；

(2)微载体培养：将单细胞群体悬液接种入装有微载体的容器中培养；

(3)滑膜细胞微载体培养上清中透明质酸的提取：将TGF-β、TNF-α、EGF、 rhEGF或者HGF加入培养基，刺激后换液，留取培养上清液，并对培养上清液进 行离心，收集离心后的上清液，取需要量的上清液，经高效液相色谱提取分子量 大于100万的大分子透明质酸；