[发明专利]丙型肝炎病毒的小分子核苷酸适配子药物及制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于微生物感染免疫和检验领域，具体涉及一种能特异性抑制丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染人细胞的小分子核苷酸序列(或称DNA适配子)，具有SEQIDNO.1-29所示的小分子核苷酸序列(或称单链DNA适配子)。同时还涉及制备能与丙型肝炎病毒特异结合，特异性拮抗丙型肝炎病毒感染的高亲合力的小分子DNA适配子的方法，小分子的DNA适配子在制备治疗或预防丙型肝炎病毒感染人细胞的药物中的用途，该DNA适配子核苷酸同时还作为检测丙型肝炎病毒包膜抗原的临床新型诊断试剂。 

背景技术

1989年首次鉴定出丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)，至今已有大约170万的世界人口感染有HCV，我国感染者占全国总人口3.2％，其中80％的感染者发展成为慢性。HCV是HIV感染的5倍，并且艾滋病合并HCV感染发病率高达60％～80％，并且我国HCV感染率将有可能逐渐升高。 

医源性的输入HCV所污染的血液是丙型肝炎传播的主要方式，丙型肝炎发病缓慢及隐匿易形成慢性肝炎和肝硬化，后期常发展成为肝细胞性肝癌。临床上主要将α干扰素或将α干扰素和病毒唑等抗病毒的药物联合应用来治疗丙型肝炎，这种治疗方法往往也只是对早期病人的效果比较明显。目前无疫苗预防。因此在血液样品中正确及灵敏的检测HCV是防范HCV的关键。 

HCV为单股正链RNA病毒，属于黄病毒家族，基因组(大约9.6kb)含有一个开放阅读框编码3010氨基酸的蛋白前体。通过宿主和病毒蛋白水解酶的共同作用形成9个不同的结构和非结构蛋白，宿主信号肽的剪切后，HCV包膜糖蛋白E1(gp35)和E2(gp70)形成。虽然在分子水平上病毒感染和复制的确切机制还未明了，但是包膜糖蛋白E2在HCV病毒感染的初始和通过与人CD81为主的细胞受体分子的识别和结合，在宿主细胞的粘附和侵袭中都起到了十分关键性的作用已经被 公认。 

HCV-E2DNA适配子作为早期诊断试剂及拮抗HCV的治疗药物，为献血者HCV的筛选、早期感染的确诊、抗HCV感染和丙型肝炎的治疗提供了一条新的途径。此外，适配子还将在某些方面取代抗体，成为一种新的受体抑制剂和检测试剂，其应用前景十分诱人。 

SELEX技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，系统进化指数富集技术)是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术，基本原理是运用大容量的随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得高亲和力、特异性强的寡核苷酸适配子(aptamers)，具有库容量大、靶分子范围广、亲和力高等优点，应用范围十分广泛。已成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、蛋白质、药物、氨基酸以及各种细胞因子等。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具有更高的亲和性和特异性，具有良好的应用前景。适配子与传统意义上抗体相比，具有分子量小，能更快地渗入细胞，更迅速在血液中清除，能够稳定合成，便于修饰等特点。是极有潜力的作为预防、诊断和治疗疾病的新型试剂。本研究中，我们采用SELEX技术对CT26-HCV-E2细胞进行筛选，并用CT26细胞进行反筛，以获得能特异性拮抗丙型肝炎病毒包膜糖蛋白的生物活性小分子核苷酸适配子(Aptamer)分子。为丙型肝炎病毒感染机制的研究，丙型肝炎治疗性新型药物和新型诊断试剂的开发而奠定基础。 

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种丙型肝炎病毒的小分子核苷酸适配子，该DNA适配子为预防和治疗丙型肝炎提供了新型的拮抗剂，可以克服临床只以α干扰素或将α干扰素和病毒唑等抗病毒的药物联合应用来治疗丙型肝炎，且只是对早期病人的效果比较明显，并且联合治疗副作用大。丙型肝炎无疫苗预防。 

本发明的另一个目的是提供了一种制备能特异性拮抗丙型肝炎病毒的小分子核苷酸适配子的方法，该方法通过随机单链DNA文库和引物的构建、合成双链DNA文库、PCR扩增、SELEX筛选、体外细胞水平抑制HCV-E2蛋白与受体的结 合实验，HCV活病毒结合和抑制实验，得到能抑制HCV-E2蛋白结合DC-SIGN、CD81等受体以及抑制活病毒侵袭肝细胞的DNA适配子。其优点在于DNA适配子预防HCV的入侵和进一步扩散的同时无抗原性，容易被排泄。