[发明专利]基于磁珠探针复合物分离短散在重复序列的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，涉及一种从基因组中快速大规模分离短散在重复序列(SINE)的方法。该方法基于磁珠分选系统直接正向分选，将探针绑定于磁珠，在溶液中与放大的酶切基因组片段库杂交，直接捕获大量含有短散在重复序列(SINE)的目的片段。

背景技术

短散在重复序列(SINE)是一种长度在50-500bp，广泛存在于真核生物基因组中的一种反转座子。它的拷贝数一般在10⁴-10⁶左右，散在或丛生于基因组的任何部位。典型的SINE由tRNA相关区，家族特异区和尾部区三部分组成。SINE被认为是用来研究生物类群系统发育关系和群体遗传学的绝好标记。近年来研究表明，SINE插入到基因的附近，能作为增强子或沉默子调节已知基因的表达。

目前用于分离SINE的方法主要是利用含SINE(短重复序列)的探针杂交扫描基因组文库，分离出含有SINE的克隆。整个过程需要首先构建一个基因组文库，然后放射性或生物素荧光标记SINE探针，通过多轮斑点southern杂交的方法来扫描文库，筛选出阳性克隆。这种传统的方法，需要的工作量大，耗时长，成本高，难操作，效率低。

本发明利用磁珠筛选系统实现短散在重复序列(SINE)快速高效的分离，是一种不同于传统文库法的新策略和新方法。近年来，磁珠分离系统被许多研究者开发用于分离许多目标，如特定细胞，特定蛋白，微卫星的分离等，本发明设计实验方案将磁珠分离系统首次应用于短散在重复序列(SINE)的分离。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，本发明的目的是在于提供了一种基于磁珠探针复合物分离短散在重复序列的方法，该方法简单、高效、快速，缩短了实验周期，降低了成本消耗，极大的提高了效率，将磁珠分离系统应用到分离短散在重复序列(SINE)上。该方法基于磁珠分选系统，能直接从酶切后的基因组DNA中钓取含有短散在重复序列(SINE)的片段群。

为实现上述这一目的，本发明采用以下技术措施：

首先需要将含有单拷贝SINE序列的片段生物素标记并使其单链化，然后将此生物素标记的单链探针其绑定到活性磁珠上，在杂交液中与酶切后的基因组DNA杂交，杂交完成后通过磁铁架将磁珠保留，目的片段由于与探针形成双链体被绑定与磁珠上从而得以保留，非目的片段留存在溶液中被丢弃，从而实现了目的片段群和非目的片段群的分离，最后将磁珠上捕获的含有SINE的目的片段洗脱下来，克隆并测序。

本发明的方法具体包括如下步骤：(见附图1)

A.基因组片段富集库的制备。第一步：酶切基因组DNA。100微升的酶切体系中加入约40微克基因组DNA，及20单位的限制性内切酶HaeIII，过夜消化完全酶切。酶切后图谱如图2A，基因组DNA被均匀酶切于4KB以下，回收500bp-2kb片段溶于40微升无菌水中。第二步：加接头。生成接头的两条寡聚核苷酸分别为A：5P‘GGCAGGATCCACTGAATTCGC-3’和B：5’-AGCGAATTCAGTGGATCCTGCC-3’。两条寡核苷酸在终浓度为10μM的无菌水中执行如下过程实现两条链的聚合形成接头：95℃3分钟，65℃2分钟，45℃2分钟，25℃1分钟，4℃保存。形成的双链接头一端被磷酸化标记另一端有一个突出的碱基A，这样能使接头定向连接到片段上且能阻止第二个接头的继续加入。100μl连接体系中包含40μl酶切基因组片段(见第一步)，终浓度为2μM的双链接头，终浓度lx连接缓冲液，20单位T4DNA连接酶，22℃连接过夜。最后将上述连接液过柱回收溶于150μl无菌水。第三步：PCR反应富集片段库。用oligo B做引物，平行进行20个PCR反应，每管50微升反应体系中加入上述连接回收产物1微升作为模板进行PCR反应。PCR程序为72℃，5min；12个循环中95℃45秒，55℃45秒，72℃1分50秒，最后回收溶解于150μL H₂O中。