[发明专利]一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法。

背景技术

阿维菌素(Avermectins)是1976年美国Merck公司从日本北里研究所提供的一株放线菌新种---阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis，简称S.avermitilis)发酵中获得一簇结构相似的新型化合物。它是一类新型大环内酯类抗生素，其分子由一个16元内酯环与两个齐墩果糖糖苷配基构成。天然阿维菌素有八种组分，主要是在C5、C22-C23和C26等三个位置存在结构差异。八种组分中以B1a的杀虫活性最高，其它异构体杀虫活性较低且毒性较高。在通常情况下，菌株的发酵产物中A1a、A2a、B1a和B2a组分之和的比例在80％以上，而A1b、A2b、B1b和B2b组分之和的比例在20％以下。该簇结构相似的化合物被统称为阿维菌素或称阿弗菌素。阿维菌素对家畜的肠内寄生虫具有极其有效的驱虫活性，并具有作用机制独特、有效剂量低、安全性高等特点，是一种有着良好市场应用前景的生物农药；同时阿维菌素也是高效的杀虫、杀螨剂，其衍生物也可用于治疗人类由于螨虫或线虫引起的疾病。

现有，对阿维链霉菌的培养主要采用菌丝接种培养和挖块接种培养，这两种接种方式接种量很难控制，发酵结果不稳定，效价增幅不明显。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明通过采用全孢子接种，设计提供一种生产阿维菌素的方法。

所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

(1)将阿维链霉菌接种至斜面培养基，在温度27-29℃下，培养7-9天；

(2)取上述的阿维链霉菌孢子斜面，用无菌水振荡洗涤斜面制备成孢子悬浮液；

(3)计算孢子悬浮液中孢子的数量，然后用移液管吸取孢子悬浮液至种子培养摇瓶中的种子培养基中，使每毫升种子培养基的孢子接种量为4×10⁷-6×10⁷个，种子培养摇瓶装量为30-50ml种子培养基/250ml摇瓶；

(4)将步骤(3)的孢子悬浮液进行摇床培养，在温度27-29℃下，转速为200-300r/mim的旋转式摇床上培养40-48小时，得到全孢子液；

(5)取上述的全孢子液，按培养基体积3％-7％的接种量，接种到发酵培养基中，进行摇床培养，发酵摇瓶装量为20-40ml发酵培养基/250ml摇瓶，在温度27-29℃下和湿度40％-50％下，转速为200-300r/mim的旋转式摇床上培养240-260小时，得到含有阿维菌素的发酵液。

所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于所述的斜面培养基组分重量百分比为：酵母膏0.1％、麦芽糖0.1％、胰蛋白胨0.2％、葡萄糖0.4％、琼脂粉2％，余量为蒸馏水，并使pH值调至7.2。

所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于种子培养基含有：玉米淀粉30g/L、玉米浆5g/L、酵母膏15g/L、KH₂PO₄4g/L、MgSO₄·7H₂O0.2g/L，并调pH为7.0-7.2。

所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于发酵培养基含有：玉米淀粉120g/L、酵母粉15g/L、豆粕粉5g/L、花生饼粉5g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L，并调pH为7.0-7.2。

所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于步骤(3)中用采用血球记数板计算孢子悬浮液中孢子的数量，每毫升种子培养基的孢子接种量为4×10⁷-5×10⁷个，种子培养摇瓶装量为30-40ml种子培养基/250ml摇瓶。

所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于步骤(3)中每毫升种子培养基的孢子接种量为5×10⁷-6×10⁷个，种子培养摇瓶装量为40-50ml种子培养基/250ml摇瓶。

所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于步骤(4)中摇床培养条件为：温度为27-28℃，摇床转速为230-270r/mim，培养时间为42-46小时。