[发明专利]一种呋喃唑酮的化学发光酶联免疫检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于药物残留分析和免疫技术领域，涉及硝基呋喃类的酶联免疫检测试剂盒，特别涉及一种呋喃唑酮的化学发光酶联免疫检测试剂盒。

背景技术

呋喃唑酮(FZ)是一种硝基呋喃类的广谱抗生素，价格低廉，杀菌效果好，可以有效治疗多种由革兰氏阳性和阴性菌引起的感染，并对某些原虫、真菌有一定作用，从而被广泛应用于畜禽及水产养殖业，并被作为治疗药物和饲料添加剂。但是，呋喃唑酮在体内迅速代谢，代谢产物为3-氨基-2-唑酮(AOZ)，该分子与细胞膜蛋白结合成为结合态，可长期保持稳定，从而延缓原药在体内的清除速度。而普通的食品加工方法(如烧烤、微波加工、烹调等)难以使蛋白结合态残留物大量降解，食用含有该残留物的肉制品会对人体产生一定的毒副作用。蛋白结合态的呋喃唑酮残留物含有称为3-氨基-2-唑酮(AOZ)的完整侧链，在人胃的弱酸性条件下，侧链可以从蛋白结合态的母体分子上解离下来，AOZ可以代谢成为β-羟乙基肼，该代谢物有致突变性和致癌性。基于此原因，欧盟已于1995年禁止在食用动物中使用硝基呋喃类抗生素，在动物源性食品中呋喃类残留物的检出限为不得检出。2004年美国也公布了禁止在进口动物源性食品中使用呋喃唑酮。我国也于2002颁布了禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令。因此，为了保障人民身体健康，保证进出口动物源性产品的质量，需要寻求一种快速、灵敏、方便的呋喃唑酮残留的检测方法。

已经报道的检测呋喃唑酮残留的方法主要有：高效液相色谱法(HPLC)、色/质联用分析法(LC-MS)和酶联免疫法。HPLC和LC-MS都有高灵敏度、高特异性的特点，但是它们需要昂贵笨重难以携带的仪器，大量的有机溶剂，繁琐的衍生化及费时的样品处理过程。ELISA分析与其它方法相比，优势在于灵敏度高，特异性强，仪器设备要求不高，测定成本低，方法快速、简便，试剂保存时间较长，自动化程度高，无放射性同位素污染，可现场操作进行快速大批量的检测。故研究开发一种快速、灵敏、方便呋喃唑酮的酶联免疫检测试剂盒具有直接的经济效益和社会效益。

发明内容

本发明的目的是改进现有检测技术，提供一种检测呋喃唑酮的化学发光酶联免疫检测试剂盒。

本发明所述呋喃唑酮的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由呋喃唑酮的代谢物3-氨基-2-唑酮(AOZ)与卵清蛋白偶联制成；所述试剂包括：呋喃唑酮的多克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体、呋喃唑酮系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、发光液。

其中：所述酶标板优选乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板。

所述包被抗原浓度优选5μg/mL。所述包被抗原制备具体由3-氨基-2-唑酮(AOZ)按照戊二醛法与活化的分子量范围是6.7KDa～6.8KDa的卵清蛋白(cOVA)偶联完成；其中涉及的反应方程式是：

上述呋喃唑酮的多克隆抗体的工作浓度优选1:4000。

所述呋喃唑酮的多克隆抗体是由呋喃唑酮的代谢物3-氨基-2-唑酮(AOZ)与对醛基苯甲酸反应得到的衍生物3-(4羧基苯亚甲基)-氨基-2-恶唑烷酮(CPAOZ)与分子量范围是6.7KDa～6.8KDa的牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔制备得到；其涉及的反应方程式为：

上述呋喃唑酮的化学发光酶联免疫检测试剂盒中：

所述辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体的工作浓度优选1:1000。

所述呋喃唑酮系列标准溶液浓度分别为：0.1ng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、1ng/mL、5ng/mL和10ng/mL。

所述浓缩磷酸盐缓冲液是每升含NaCl 80g、KH₂PO₄ 2.0g、Na₂HPO₄.12H₂O 29.0g、KCl 2.0g的水溶液。

所述浓缩洗涤液是含有体积分数0.05％吐温-20的pH7.5、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。

所述发光液是0.01M鲁米诺与pH＝8.8、0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液和体积比浓度为3/10000H₂O₂的混合液。所述鲁米诺为发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。