[发明专利]旋毛虫通用型实时荧光PCR检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种各旋毛虫隔离种线粒体Ls-rRNA基因片段的PCR扩增引物和探针，及同时进行各旋毛虫隔离种的通用检测方法。

(二)背景技术

旋毛虫病(Trichinosis)是一种重要的人兽共患寄生虫病，主要因生食或半生食含有旋毛虫幼虫囊包的猪肉或其他动物肉类而感染。由于其宿主特异性极差和病原传播途径的多样性，几乎所有哺乳动物均可感染。无论是肉食、杂食动物还是虫食、草食动物都可以感染，甚至某些鸟类也可感染，人也是旋毛虫的易感宿主之一。截止到目前为止，至少已报道150多种哺乳动物可以感染旋毛虫，常见的有人、猪、鼠、犬、熊、狐、狼、貂等。

该病发现一百多年来，不仅没有得到完全有效的控制，而且发生范围反而逐渐扩大。本病对人类健康威胁很大，可因心肌炎、肺炎等引起人的死亡，目前全世界大约有1100万人体感染者，世界卫生组织(OIE)和国际旋毛虫病委员会(ICT)已将其列为再次出现的疾病。《中华人民共和国农业部动物防疫法》中将猪旋毛虫病列为二类动物疫病。我国《肉品卫生检验规程》中规定，在生猪屠宰时必须逐头进行旋毛虫病的检疫，阳性猪必须销毁。目前除澳大利亚及某些岛屿外，其分布几乎遍及全球各地，已成为一种全球性自然疫源性疾病。该病对畜牧业(尤其是养猪业)、肉食品工业和外贸出口等造成巨大经济损失，而且传统的检疫方法漏检率极高，严重影响了我国食品卫生安全的国际形象。

近年来，根据遗传学、生物学和生物化学研究均提示旋毛属含有多个隔离种。目前认为旋毛虫属至少存在有8个隔离种(isolate)，即旋毛形线虫(T.spiralis，T1)、本地毛形线虫(T.nativa，T2)、布氏毛形线虫(T.britovi，T3)、伪旋毛形线虫(T.pseudospiralis，T4)、米氏毛形线虫(T.murrelli，T5)、尼氏毛形线虫(T.nelsoni，T7)、巴布亚毛形线虫(T.papuae，T10)、津巴布韦毛形线虫(T.zimbabwensis，T11)和3个分类地位尚未确定的基因型(genotype)，即T6、T8和T9。每种旋毛虫的地理分布、宿主、对人体的致病作用及生物学特性等均不相同。

目前，我国至少存在有两种旋毛虫，即T.spiralis和T.nativa。

近年来人们对旋毛虫的排泄分泌抗原进行了广泛深入的研究，并建立了一些基于ELISA的诊断检测方法，虽然用ELISA等技术检测旋毛虫病具灵敏和特异的特点，但多数是用抗原检测抗体，然而有时抗体的存在与否并不总是和肌幼虫的出现与否相一致。有报道在人工感染旋毛虫16～20周后，骨骼肌内有活肌幼虫存在，但此时却检测不到抗体，出现假阴性结果。直接用抗体来检测旋毛虫病患者血清中的循环抗原(CAg)，检出率很低，临床上仅有47％的患者能测出CAg。

随着分子生物学技术的发展，国内外学者在旋毛虫的基因诊断方面也做了大量的研究。Klassen等(1986)在用限制性内切酶EcoRI消化旋毛虫基因组DNA时，发现有一长度为1.7Kb的重复序列其拷贝数为2,800，在基因组中呈直接串联排列，占整个基因组DNA的2％，该片段对猪型旋毛虫有株特异性。Dupouy(1991)等根据该序列设计了一对PCR引物，结果从两种样品中都可扩增出602bp的特异性DNA，其灵敏度可达到2ngDNA(相当于0.02条肌幼虫)。Zarlenga等(1991)从构建的森林野生动物型旋毛虫虫株的DNA文库中筛选到一特异性重复序列PUPB-3.7(482bp)，以此为探针对20株森林野生动物型旋毛虫的DNA进行分子杂交，有19株呈阳性反应，并可检测到0.4ng的基因组DNA。Dubey等(1994)也用此探针对来源于黑熊体内的旋毛虫进行鉴定，证明PUPB-3.7对森林野生动物型旋毛虫有株特异性。但是系统的基因诊断研究鲜有报道，而且目前尚无各旋毛虫隔离种通用型检测方法。

实时荧光PCR技术是具有巨大发展潜力的高新检测技术，在许多领域已得到了广泛的应用，该技术不仅实现了PCR方法从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、检测周期短、有效解决PCR污染问自动化程度高等特点，已广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。

由于旋毛虫病原体具有多个隔离种，常规的检验检疫手段漏检率高，对检测者的主观依赖性较高，所以迫切需要建立一种特异敏感、准确可靠、快速简便的各旋毛虫隔离种“一步法”通用检测方法，用于快速检测进出口肉制品，从而满足进出口检验检疫和疫病监控的需要。

(三)发明内容