[发明专利]用于有机污染物浓度与降解效能检测的转化株及其检测方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种用于有机污染物浓度与降解效能检测的转化株及其检测方法，特别涉及一种恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)dcblux转化株及其简易快速、可现地检测之有机污染物浓度与降解效能检测的方法。

【背景技术】

工业社会中，生活环境充斥各种污染物，有些污染物能被人类感觉系统感知，例如含硫化合物、氨以及一些恶臭性的污染物，这些物质的存在虽有害于人体之健康，但相对地也很容易被人类感知，而能提早进行防范。然而，有些污染物质不易被感知，其存在将会使人类置身于危险的环境而不自知，故建立快速检测污染物的方法是保护人类免于环境危害的有效方法。现阶段的分析方法虽已具相当成效，但设备昂贵，且在操作上必须配合经过专业训练的技术人员才能达到目的，故在应用上并不方便，如能建立快速的分析方法，将有利于一般民众快速得知危险之所在。

恶臭假单胞菌对于甲苯、氯化有机物等污染的感应及代谢具有特殊机制，其可分为四个步骤，分别是(1)细胞外环境的感应：由污染物和蛋白质TodS结合；(2)胞内胞外讯息的流通：蛋白质TodS获得自我磷酸化的能力并对蛋白质TodT进行磷酸化，使蛋白质TodT具备向核酸分子靠近的能力；(3)基因(tod)表达的控制：由蛋白质TodT与基因启动子结合，启动基因表达机制；及(4)污染物的降解：经由转录和翻译程序合成酶(toluene dioxygenase)以代谢污染物。经此一连串的生化反应已将胞外污染物出现的消息传回胞内，并产生相对应的特定酶来代谢污染物。由于讯息传导系统具有高效率的调控功能，使得微生物可以在适当的时机表达出代谢污染物的酶，故酶的表达量，将取决于污染物存在量的多寡，唯最终仍受限于菌体代谢系统的协调性而达到饱和表达量。此一特性即成为本发明开发污染物浓度侦测系统和测定代谢活性的基础。

美国专利第6117643号中揭示应用甲苯双加氧酶(toluene dioxygenase)对甲苯所具有的结合能力，将结合反应发生后所启动的生物冷光反应进一步转化为电流讯号而达到侦测污染物的目的，但对于转化微生物所具备的特性并未说明。

相关文献中亦有揭示使用恶臭假单胞菌TVA8或B2株作为侦测甲苯或三氯乙烯污染物的菌株(Shingleton JT，et.al.，Biotechnol Bioeng，Quantification of toluene dioxygenase induction and kinetic modeling of TCEcometabolism by Pseudomonas putida TVA8，2001Dec；76(4)：341-50；Kelly CJ，et.al.，Kinetic analysis of a tod-lux bacterial reporter for toluene degradationand trichloroethylene cometabolism.Biotechnol Bioeng.2000Aug5；69(3)：256-65.)。然而，该二株菌不利于侦测低浓度的污染物。反之，本发明用于检测污染物的微生物为转化株，与上述文献所用的菌株并不相同，彼此间所能测定的污染物能力并不同，且本发明的转化株可侦测达ppb级的低污染物浓度，更可侦测其它污染物，包括苯、甲苯、二甲苯、乙苯、酚、四氯乙烯、三氯乙烯、二氯乙烯等，可简易快速用于现地检测之有机污染物浓度检测。

【发明内容】

发明简述

本发明的一个目的在于提供一种用于有机污染物浓度与降解效能检测的转化株，其包含至少一质粒，该质粒至少包含编码甲苯双加氧酶(toluenedioxygenase)的基因的启动子Ptod(SEQ ID NO：1)及发光光杆状菌(Photorhabdus luminescens)的lux基因(SEQ ID NO：2)。

本发明的另一目的在于提供一种恶臭假单胞菌dcblux转化株，其包含质粒ptod_lux，该转化株寄存于财团法人食品工业发展研究所(Food IndustryResearch and Development Institute)，微生物寄存号码为BCRC 940538，并于2008年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M208098。

本发明的另一目的在于提供一种利用转化株测定有机污染物浓度的方法，其中该转化株包含至少一质粒，该质粒至少包含可编码甲苯双加氧酶的基因的启动子Ptod(SEQ ID NO：1)及发光光杆状菌的lux基因(SEQ IDNO：2)，该方法包含：