[发明专利]一种量子点标记的间接竞争荧光免疫检测倍他米松的方法

说明书

技术领域

一种量子点标记的间接竞争荧光免疫检测倍他米松的方法，属于免疫检测 方法技术领域。

背景技术

倍他米松(Betamethasone，BET)属人工合成类糖皮质激素，化学名称为16α -甲基-11β，17α，21-三羟基-9α-氟孕甾-1，4-二烯-3，20二酮。具有 抗过敏、抗炎和影响糖代谢的作用，常被用于治疗家畜的炎症反应、免疫性疾 病、牛的酮病和羊妊娠毒血症等。地赛米松还常被用作生长促进剂，增加家畜 的饲料摄入量从而使其达到增重的目的。然而，经毒理学试验证明，该药物具 有致突变性、蓄积毒性，ADI值为0.000015mg/kgbw/day。若随意在饲料中添加 该药物，蓄积的药物通过食物链进入人体，将造成巨大的危害。为此许多国家将 此类药物列入禁用药物名单。当今国际上常用的倍他米松残留的检测方法有： 薄层色谱(TLC)、液相色谱(LC)、气相色谱(GC)、气-质联用法(GC-MS)、液- 质联用法(LC-MS)等，但这些仪器分析方法不仅需要昂贵的仪器设备，对检材 的要求也比较高，需要经过复杂的样品前处理才能进行。国外早已经开展了对 糖皮质激素分析方法的研究，常用的方法为酶联免疫分析法(ELISA)或称为免 疫酶定量分析法(IEMA)。这类方法是将包被原包被酶标板，加入药物及抗药 物抗体，再加入酶标二抗，即检测抗体，最后加入底物显色，一定时间后，用 酶标仪检测某一特定波长的吸光度值，根据已知标准品含量计算样品中待测药 物的浓度，此操作繁琐，费时。

发明内容

本发明的目的是提供量子点标记的间接竞争荧光免疫检测倍他米松的方 法，该方法具有高灵敏度、高特异性、高准确度、操作简单的量子点标记的荧 光免疫检测法，用于倍他米松残留的快速检测。

本发明的技术方案：一种量子点标记的间接竞争荧光免疫检测倍他米松的 方法，将包被原直接包被在酶标板的微孔中，加入倍他米松标准溶液或待测样 品形成抗原-抗体发光免疫复合体，用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗原-抗体 发光免疫复合物的荧光强度，与标准溶液对比求出待测样品中倍他米松的浓度；

(一)用变性牛血清蛋白dBSA包裹发绿光的QD590标记抗倍他米松多克 隆抗体

(1)BSA变性：

将16.5mg BSA溶于10mL双蒸水中，搅拌下加入0.42mg NaBH₄，室温下 反应1h，60-80℃下加热20min分解过量的NaBH₄，BSA变性，二硫键打开成-SH， 控制最终的dBSA水溶液的浓度为5×10^-5M；

(2)变性BSA包裹量子点dBSA-QDs：

将dBSA和量子点镝化铬CdTe按摩尔比1∶1混合，60-80℃水浴加热15min， 室温下保持两天，使包裹完全；

(3)变性BSA包裹量子点偶联抗体

将5μL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺EDC 0.056M与5μL硫代N- 羟基琥珀酰亚胺sulfo-NHS 0.1M混合10s后，加入至25μL dBSA-QDs 2×10^-5M 中，变性BSA包裹的量子点活化15min，加入7.6μL倍他米松抗体Ab，6.3mg/mL， 反应物摩尔比控制为：dBSA-QDs∶Ab∶EDC∶sulfo-NHS＝1∶1∶560∶1000，室温下反 应4h，得到量子点标记的倍他米松抗体，室温下反应4h，得到量子点标记的倍 他米松抗体，反应液中抗体的浓度为1.15mg/mL，用0.1％明胶的含吐温的pH 7.4、 0.01M磷酸盐缓冲液作抗体稀释液稀释1000倍待用；

(二)抗原的包被

用倍他米松与卵血清白蛋白偶连体作为包被原，用pH 9.6、0.05M碳酸盐缓 冲液作为包被缓冲液，用包被缓冲液将倍他米松包被原稀释至1-20μg/mL作为 包被液，在酶标板的每孔中加100μL包被液，4℃冰箱过夜，用含NaCl 8.5g/L、 pH 7.2-7.4、10mmol/L磷酸盐缓冲液洗三次，按200μL/孔加0.1％明胶进行封闭；

(三)抗原-抗体二元发光免疫复合体的形成