[发明专利]一种血清肿瘤标志物的检测方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术，涉及一种利用蛋白质组学检测裸鼠胰腺癌模型血清，以获得血清肿瘤标志物的方法，为胰腺癌的早期诊断提供动物实验基础。

背景技术

胰腺癌以发病隐匿、恶性程度高、手术切除率低、预后极差为特征，是恶性程度最高的肿瘤之一。在我国现居癌症死亡率的第六位，其5年生存率仅为1％-4％。手术根治是目前治疗胰腺癌唯一有确切疗效的方法，术后配合化疗，其5年生存率可达15％-40％。但临床上只有10％-15％的病人可获行根治性切除手术的机会，85％左右胰腺癌患者在确诊时已因出现转移等原因而失去手术根治的机会。目前尚缺乏可用于早期筛查胰腺癌的特异性肿瘤标志物。

几年来，蛋白质组学已成为检测和筛查肿瘤标记物的重要手段之一。目前，新型质谱技术以其高通量、高敏感性、采样便捷等优点广泛应用于肿瘤标记物筛选的研究。表面加强激光解吸电离—飞行时间质谱技术是最近几年才发展起来的一种新的蛋白组学研究方法，它能够直接自未经处理的生物样品获取蛋白质图谱。以这一技术为基础开发的系列蛋白质芯片可以非特异性或特异性地结合被测样本中的各种蛋白质，当在质谱仪中受到激光轰击时，各种结合蛋白质会被激发而形成气化离子，由于不同质荷比(m/z)的离子在电场中飞行的时间长短不一，因此接收装置可根据蛋白质质荷比的不同及量的多寡直观的用位置、强弱不同的峰表现出来，进而形成图谱用于分析。这一方法具有样品用量小，操作简便，灵敏度高，高通量等优点，可检测到fmol(10^-15mol)数量级的微量蛋白，并可一次性获得某一样品中成千上万个蛋白质数据。

发明内容

本发明的目的是提供一种血清肿瘤标志物的检测方法，是一种利用蛋白质组学检测裸鼠胰腺癌模型血清，以获得血清肿瘤标志物的方法。该方法为早期诊断胰腺癌提供了新的途径，并为进一步发现新的肿瘤标记物提供了基础。

本发明提供的方法包括胰腺癌模型血清蛋白质质谱、质谱仪及生物信息学分析，通过以下步骤实现：①制备血清样品|，②质谱数据的测定，③数据收集和生物信息学分析

本发明提供的人血清蛋白质质谱由三个质荷比(M/Z)位于11753Da、8615Da、8256Da的蛋白质(包括磷酸化，甲基化，乙酰基化修饰前或修饰后)所组成。

具体通过以下步骤实现：

(1)制备血清样品：取全血1ml，在4度低温离心(4000转/分钟)10分钟，取上清液，再次离心10分钟，取上清血清。10μl U9血清处理液中加入血清5μL，摇床上振荡使充分混合，用结合缓冲液(Binding Buffer)将U9处理后的血清稀释至200μl用于上样。取上述经U9处理并稀释过的血清100μl加到CM10型蛋白质芯片上，芯片与血清充分反应1小时后去除血清样品，每孔加入200μl相应的Binding Buffer，摇床上振荡5分钟(600rpm，室温)后除去液体，重复该过程2次，用水(纯度HPLC级)200μl快速清洗每个孔1次，用力甩干并将96孔蛋白质芯片工作支架(Bio-Processor)倒扣在清洁的吸水纸上轻拍以去除多余的水，将芯片从Bio-processor中取出，自然干燥，每孔点加50％饱和的能量吸收分子SPA溶液1μl，待其自然干燥后重复点加1次，自然干燥即可上机检测。

(2)利用表面加强激光解吸电离—飞行时间质谱技术(Surfance EnhancedLaser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，SELDI-TOF-MS)检测步骤(1)的血清样本，获得血清蛋白质谱，质谱仪参数设定:激光强度165，灵敏度7，数据收集范围2000一30000m/z(蛋白质质量和电荷比值，即质荷比)，每次收集数据前以标准蛋白质芯片校正分子量。