[发明专利]一种产挥发油的滇重楼内生毕赤酵母及其抗菌活性

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，涉及一种具抗菌活性内生真菌的应用，特别是涉及一种其代谢产物为挥发油的微生物-滇重楼内生毕赤酵母。

背景技术

植物内生真菌(plant endophytic fungi)是指那些在其生活史中的某一阶段或全部阶段生活在健康植物组织或器官内部，宿主植物不表现外在病害症状的真菌。植物内生真菌是一种新的微生物资源，能产生多种结构类型的代谢产物，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗虫、调节植物生长等多种生物活性。由于植物内生真菌能产生结构新颖、功能独特的代谢产物而成为新化合物、新药物的潜在资源，它们在农业、医药、工业、食品等领域具有重要的应用前景。近年来发现一些植物内生真菌能产生易挥发的成分(volatilecomponents)，这些易挥发成分具有抗菌和杀虫活性，能作为熏蒸剂应用于仓储和果蔬种植园的病虫害防治。

滇重楼(Paris polyphylla var.yunnanensis Hand.-Mazz.)在分类上属于单子叶纲(Monocotyledoneae)百合目(Liliales)延龄草科(Trilliaceae)重楼属，是我国特有的一种珍稀药用植物，又叫七叶一枝花、独角莲，主要分布在云南、四川、贵州等省区，是著名的“云南白药”、“宫血宁”、“季胜德蛇药片”、“热毒清”等中成药的主要原料。滇重楼是一种多年生草本植物，其根状茎多年生长在地下，对土传病原菌具有强的抵抗能力，这很可能与其共生的内生真菌有关，这些内生真菌能够产生抗菌活性物质来协助滇重楼抵抗病原物的侵袭，促进其健康生长。目前尚未见从滇重楼内生真菌中提取挥发性成分的报道。本发明着重于内生真菌挥发油的提取、化学组成分析和抗菌活性的研究，为探讨内生真菌的生理生态功能(如提高宿主的抗病性等)和新型杀菌剂的开发提供依据。

本发明的目的是提供一种经发酵培养能产生挥发油的微生物，即滇重楼内生毕赤酵母。

发明内容

本发明涉及一种毕赤酵母(Pichia sp.)，菌株代号为Ppf9，现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2008年4月29日，登记入册编号为2475。本发明涉及毕赤酵母的分离和分类鉴定、挥发油的制备方法和组成分析，以及挥发油对病原真菌和细菌的抑制活性，提供如下的技术方法。

1、内生毕赤酵母Ppf9的分离

采集新鲜的滇重楼根状茎，采用内生真菌的分离和纯化技术，获得一株内生真菌，编号为Ppf9。

2、内生毕赤酵母Ppf9的形态特征

(1)无性世代：内生真菌Ppf9菌株在PDA培养基上25℃培养，菌落致密，不规则突起，生长缓慢，背部有皱折，单细胞，有假菌丝，细胞卵圆形，椭圆形，无色，大小2.2μm～4.8μm×2μm～4.4μm。内生真菌Ppf9的形态特征(见图1、图2和图3)符合毕赤酵母属(Pichia)真菌的形态特征。

(2)有性世代：未发现。

3、内生毕赤酵母Ppf9的分子生物学特征

运用PCR技术，扩增采用ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。将Ppf9菌株的ITS序列提交到GenBank核酸序列库中注册获得序列号(accession number)EF495244。同时将Ppf9菌株的ITS序列与GenBank中其他真菌的ITS序列进行比对，找出相似性最高，亲缘关系最近的真菌，Ppf9菌株的ITS序列与季氏毕赤氏酵母(Pichia guilliermondii)DQ663478的ITS序列相似度为99％，聚在一个分支上的可信度为100％。其同源性的系统发育树图见图4。

4、内生毕赤酵母Ppf9的发酵培养特征

培养基：液体马铃薯-葡萄糖(PD)培养基。

培养温度：25±1℃。

是否光照：否。

培养时间：7天。

摇床转速：150rpm。

培养特征：培养第3天，菌液无色，菌体聚集成球状；培养第5天，菌液略带橙红色；培养第7天，菌液为深红色，菌丝成小球状。

5、内生毕赤酵母Ppf9挥发油的制备

采用水蒸馏法制备内生毕赤酵母挥发油，得率为0.17％(g/g鲜重)

6、内生毕赤酵母Ppf9挥发油的化学组成分析