[发明专利]一种促进兰科植物种子萌发的真菌的分离及筛选方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，具体地说涉及一种促进兰科植物种子萌发的真菌的分离及筛选方法。

背景技术

兰科是世界上开花植物中最大的科，全世界约有800属，25000种。由于兰科植物具有较高的药用价值或观赏价值受到广泛关注以及大量采挖，加上近年来兰科的许多生境受到人为破坏，许多种已经到了濒危状态。目前全世界所有的野生兰花种类都已经列入了濒危野生动植物国际贸易公约(Convention On International Trade in Endangered Species of Wild Faunaand Flora，CITES)。为了达到保护的目的，在拯救和保护珍稀濒危野生物种的同时，还要对物种所在的整个生态系统进行研究，做到有效的保护。兰科植物是典型的与真菌共生才能够在自然界生长的植物，研究共生真菌是保护兰科植物的一个重要内容。

兰科植物的种子被称为“灰尘种子”，具有以下特点：种子细小，种子的宽度一般在100-200微米，最小的种子仅10微米，最大的也超不过1毫米；种子量巨大，每个蒴果内都有几万到几十万粒种子；种子的结构简单，成熟时只有原胚阶段，没有胚乳。兰科种子的萌发非常困难，在自然界中的萌发率极低，必须与合适的真菌共生，靠消化萌发真菌获得营养，萌发真菌起到了启动种子萌发的作用。如果获得了萌发菌，利用互作技术可以使种子在自然条件下萌发，获得大批量的优质种苗。与种子的无菌组织培养相比，具有明显的优势。可以说，筛选获得萌发真菌是解决兰科植物濒危状态，实现大面积人工栽培的重要途径，而且对于野生资源的保护也有重要意义。

由于兰科植物的种子很微小，在自然界，种子萌发初始阶段形成的原球茎或刚生长出一片叶的小幼苗很难被发现。寻找优良的萌发真菌非常困难，犹如大海捞针。过去，依靠从植株的根部分离内生真菌，然后与种子互作，试图找到萌发真菌。但是兰科植物往往具有以下特点：在不同的发育阶段需要与不同的真菌共生才能生长。比如：腐生兰天麻在种子萌发阶段需要与紫其小菇相互作用才能够萌发，而萌发后又必须与蜜环菌互作才能够进一步生长为成品天麻。当然，从对真菌的依赖性来看，附生兰或地生兰没有腐生兰那么强烈，但是，实验结果也表明，在成株根部的内生真菌中，几乎没有促进种子萌发的真菌或者促萌发作用很微弱。而且，兰科成株根内的共生真菌种类非常多，筛选萌发菌株变得非常困难。耗费很大的人力物力，最终很可能得不到成果。

依据兰科种子的特点，即兰科植物种子在自然界萌发，必然是依靠真菌提供营养而萌发这一科学原理，我们设计了一套简便易行、成效好的分离萌发真菌的方法。具有研究和应用价值。

发明内容

本发明针对从兰科植物成株根内分离萌发真菌成功率低的缺点，提供一种简便的从自然界间接分离获得兰科植物萌发真菌的方法。

本发明的目的是获得兰科植物的萌发真菌，从而解决兰科植物种子的共生萌发难题。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案。

1、兰科植物种子的播种

采集兰科植物近成熟或成熟期的果实，收集种子并装在袋中，将袋放置于适宜兰科植物生长的环境中；制作袋的材料可以为：微孔塑料膜或化纤布或棉布或尼龙网。

2、促进兰科植物种子萌发的真菌的分离及纯化

装好种子的袋子放置后，定期检查种子发育情况，发现种子萌发后，取出袋子带回；取出袋内的种子或原球茎或幼苗材料，表面消毒处理后，将其剪切成小块或挑取单个菌丝圈接种到分离真菌的培养基上培养，待生长出真菌菌丝后，将真菌转接到常规真菌培养基上进行纯化；

种子或原球茎或幼苗材料的表面消毒方法为以下两种：

(1)0.1％升汞溶液浸泡0.5-4分钟，无菌水冲洗2-4次；

(2)2-5％次氯酸钠溶液浸泡1-4分钟，无菌水冲洗2-4次；

3、兰科植物种子萌发真菌的筛选确定

采集兰科植物果实获得种子，将种子播种在经过灭菌的载体上；在装有有机物固体培养基的容器内分别接种上述纯化的真菌，同时将播种子的载体放在上述接真菌的有机物固体培养基表面；将培养容器置于8-27℃的环境中共培养，其中能促进兰科植物种子萌发的真菌即为有效真菌。

兰科植物种子萌发真菌筛选用的载体可以是：树叶，纸片，尼龙网，薄膜，树皮，布料，铜网。

固体培养基的有机物可以为：谷类水提物，豆类水提物，麦类水提物，土壤或树皮浸提液。

如上所述的方法，真菌的分离培养基的组成按重量百分比计可以为以下3种：