[发明专利]一种联合限制性酶切法和质谱法以检测SNP的方法

权利要求书

1.一种联合限制性酶切法和质谱法以检测单核苷酸多态性的方法，包括以下步 骤：

(1)确定SNP位置：针对待检核酸序列可能存在的SNP，确定SNP在待检序 列中的位置；

(2)设计正向引物：根据SNP的位置，设计正向引物，其中正向引物3’端位于 SNP位点5’端上游1-47bp处，正向引物5’端含有一种特殊限制性内切酶 的识别位点，而在待检核酸序列中，所述的特殊限制性内切酶的酶切位点 位于识别位点3’端下游1-25bp处，并位于SNP的5’端上游1-25bp的范围 内，其中，所述的位置范围取决于具体的限制性内切酶；

(3)设计反向引物：根据SNP的位置，设计反向引物，其中反向引物位于另一 条核酸互补链上的SNP位点5’端上游1-47bp处，反向引物5’端含有同一 种特殊限制性内切酶的识别位点，而在待检核酸序列中，所述的特殊限制 性内切酶的酶切位点位于识别位点3’端下游1-25bp处，并位于SNP的5’ 上游端1-25bp的范围内，其中，所述的位置范围取决于具体的限制性内切 酶；

(4)PCR扩增：通过PCR扩增，获得包含两个特殊限制性内切酶的识别位点、 两个酶切位点、SNP位点的双链扩增产物，其中SNP位点位于正向引物限 制性内切酶酶切位点和反向引物限制性内切酶酶切位点之间；

(5)限制性内切反应：使用所述的特殊限制性内切酶分别进行限制性内切反 应，获得两条包含SNP位点的单链短片段；

(6)质谱检测：将包含SNP的单链短片段进行质谱检测，通过与野生型单链短 片段的分子量进行比较，确定SNP的基因型。

2.权利要求1所述的方法，其中所述的特殊限制性内切酶在两条互补链上的酶 切位点可以是同一位点，并产生平末端酶切产物。

3.权利要求1所述的方法，其中所述的特殊限制性内切酶在两条互补链上的酶切 位点可以是不同位点，并产生粘性末端酶切产物。

4.权利要求2或3所述的方法，其中所述的特殊限制性内切酶选自Bsm I、Bsr I、 Ear I、Sap I、BspQ I、Bsa I、BsmA I、BsmB I、BsrD I、BstF5 I、Bts I、BtsC I、 Bbs I、Alw I、Bcc I、Ple I、Fau I、BfuA I、BspM I、Aat II、Bmr I、Mly I、SfaN I、Hga I、BciV I、HpyA V、Mnl I、Hph I、Mbo II、Bbv I、BspCN I、FokI、BseR I、BsmF I、BtgZ I、Eci I、BceA I、Bpm I、BpuE I、Bsg I、Acu I、Mme I、NmeA III或EcoP15 I。

5.权利要求4所述的方法，其中在进行质谱检测之前，还包括对酶切产物进行 纯化处理，以减少对最终检测结果的干扰，提高分辨率。

6.权利要求5所述的方法，其中纯化方法包括树脂纯化。

7.权利要求5所述的方法，其中所述的质谱检测包括：将基质与纯化后的酶切 产物点到质谱仪所用的检测靶上，供下一步的质谱检测，基质的具体配方和与 用量视样品浓度、样品用量、环境条件、机器状态而定。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的质谱检测是利用高分辨率的基质辅 助激光解析电离飞行时间质谱检测酶切片段的分子量。