[发明专利]南方豇豆花叶病毒检测用引物

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及南方豇豆花叶病毒检测用引物。

背景技术

南方豇豆花叶病毒(Southern cowpea mosaic virus，SCPMV)是南方菜豆花叶病毒属(Sobemovirus)重要病毒之一，主要自然寄主为豆科植物。SCPMV非常稳定，致死温度90-95℃，稀释终点10^-5-10^-6，体外存活期最长可达165天，而且该病毒还可通过种子传播。2007年9月，厦门出入境检验检疫局首次从进口的豇豆种子中截获该病毒，这也是我国首次从进境种子中检出该病毒。因为国内学者对该病毒的研究较少，相关资料及防治经验缺少。

SCPMV抗原性较强，容易研制出高滴度的特异抗血清，一般可达1/2048至1/4096。SCPMV与同属的南方菜豆花叶病毒(Southern beanmosaic virus，SBMV)有非常密切的血清学关系，因此很难通过血清学检测将SCPMV和SBMV准确鉴定。近年来已经广泛应用于分子检测领域的聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction，PCR)为实现这一目标提供了解决方案。

本发明选择南方豇豆花叶病毒外壳蛋白基因和3’端非翻译区序列，设计用于RT-PCR检测的特异性引物，通过反转录和PCR扩增建立了南方豇豆花叶病毒的分子检测方法，反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果。

发明内容

本发明目的在于提供用于南方豇豆花叶病毒RT-PCR检测的引物序列。

本发明通过分析已报道的SCPMV外壳蛋白基因和3’端非翻译区序列，设计SCPMV特异性引物。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1&2所示。

本发明还进一步给出了应用上述引物的RT-PCR检测方法，其以样品总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，反应结束后根据特异性扩增的979bp DNA片段判定结果。

具体地说本发明以样品总RNA为模板，进行RT-PCR反应。RT-PCR反应包括反转录和PCR扩增两个过程。

首先在20μL反应体系进行反转录反应，即在0.2mL的反应管中加入6.75μL DEPC处理水，4μL总RNA，1μL SCPMV-RP(10μmol/L)，1μL dNTP(10mmol/L)，混匀后于65℃保持5min，迅速转移到冰上骤冷5min；然后向反应管中加入2μL DTT(0.1mmol/L)，4μL 5×反转录缓冲液，1μL RNA酶抑制剂(40 U/μL)，0.25μL反转录酶(200U/μL)，42℃反应50min；72℃15min灭活反转录酶后获得反转录产物cDNA。

PCR反应体系为50μL，即在0.2mL的PCR反应管中加入30.5μL DEPC处理水，2μL cDNA，2μL SCPMV-FP(10μmol/L)，2μLSCPMV-RP(10μmol/L)，10×PCR缓冲液5μL，8μL dNTP(2.5mmol/L)，0.5μL DNA聚合酶(5U/μL)。反应条件为：94℃，5min；94℃30s，52℃45s，72℃1min，共30个循环；72℃延伸5min。

进一步，还可以将本发明引物及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。

本发明根据南方豇豆花叶病毒外壳蛋白和3’端非编译区序列设计引物，该引物特异性好，用于SCPMV的RT-PCR检测。本发明检测方法具有高特异性和灵敏度，其能够快速准确地判断样品是否有SCPMV，为进出口安全提供了保证。

附图说明

图1是应用RT-PCR检测南方豇豆花叶病毒的结果，其中，1为100bp ladder，2为SCPMV阳性对照，3、4为SCPMV侵染发病植株，5为健康植株，6为SBMV阳性对照，7为SBMV阳性对照；1～6为SCPMV特异性RT-PCR产物扩增；7为SBMV特异性引物扩增。

图2是本发明检测方法的灵敏度试验结果，其中，1为100bpladder，2～7为发病样本，50μL反应体系中总RNA分别为5μL，4μL，3μL，2μL，1μL，0.5μL。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1引物设计和合成

根据SCPMV外壳蛋白和3’端非编译区(GenBank No.M23021)的公开序列，采用引物设计软件Primer 5.0设计引物，引物序列为：