[发明专利]一种基于piggyBac转座子的弓形虫基因转移载体及构建方法

说明书

技术领域

本发明旨在提供一种基于piggyBac转座子的弓形虫基因转移载体，同时还公开 了该载体的构建方法，属于生物技术领域。

背景技术

弓形虫病(Toxoplasmosis)是由弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的一种世界 性分布的人兽共患寄生虫病。人类弓形虫感染率极高，在某些情况下可引起严重疾 病，如孕妇感染弓形虫可影响胎儿的发育，严重者致畸甚至死亡，同时可使孕妇流 产或早产；对于免疫抑制或免疫缺陷病人，弓形虫是一个主要的机会性致病因素。 孕妇感染弓形虫后有30％～46％的机率从母亲传播给胎儿，引起胎儿先天性感染，造 成流产、死胎或先天性弓形虫病；有6％～10％的艾滋病患者并发弓形虫病，而艾滋病 病人所患脑炎有50％是由弓形虫感染引起的。据调查，孕产妇和肿瘤患者弓形虫抗体 阳性率高达10％～60％。猫、犬、猪、羊、牛、兔等家畜感染弓形虫非常普遍，其感 染率高达10％～50％，不仅造成家畜流产，影响畜牧业生产，而且成为人类弓形虫病 的主要传染源。因此，弓形虫病已成为我国亟待解决的重要公共卫生问题之一。弓 形虫病迄今仍然没有理想的防治药物，由于弓形虫感染后可引起宿主保护性免疫应 答，因此研制安全、有效的疫苗应是弓形虫病较好的防治对策。

近年来弓形虫基因组测序已经完成，并鉴定了部分弓形虫毒力相关基因及一些 抗原基因，为弓形虫的药物研制及疫苗研究提供了一些候选靶标，但是仍有大量功 能基因需要鉴定，如弓形虫发育调节基因、其它重要毒力基因等。

鉴定弓形虫的功能基因，首先需要构建其突变体，目前可以使用的方法包括化 学诱变、基因打靶、RNA干扰(RNAi)等技术，这些方法各有优缺点。运用化学诱变 方法构建弓形虫Tbd^-突变体，表现为缓殖子形成能力减弱，但不能确定其分子机理； 通过基因打靶技术鉴定了弓形虫的部分毒力、代谢相关基因，但是这种方法一次只 能构建一个突变体，并且效率不高，工作量很大。RNAi技术在操作上也很复杂，首 先需要根据靶基因序列设计大量siRNA分子，然后逐一验证其基因沉默效果，并且 在效果上也很难达完全的基因沉默。

piggyBac转座子是来源于鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的DNA转座 子，全长2.476kbp，含有1个RNA聚合酶II启动子区和1个多聚腺苷酸信号，该信 号的侧面是1个约2.1kb开放读码框，编码1个68kDa的转座酶。piggyBac转座 子的末端是长13bp的反向重复序列，两端不对称地分布着19bp的内部反向重复 序列。piggyBac转座子反向重复序列的5′末端含有2-3个C碱基，3′末端的G碱 基在切出位点的选择过程中起作用。该转座子转座频率高，且总是在TTAA位点插入， 被归入TTAA可转移因子家族。作为一种基因诱变工具，piggyBac转座子具有较高的 转座效率，可快速、高效地产生大量稳定传代的带有单个piggyBac转座子的突变体， 从而避免了传统的基因打靶等诱变方法，大大节约了成本；负载容量大，可同时携 带含有多个基因的大片段DNA；转基因可长期稳定地表达；并且以单拷贝形式整合， 更易模拟内源基因的表达状况；利用反向PCR可方便地确定piggyBac插入基因组的 位置，从而确定基因功能；piggyBac能广泛插入基因组中，尤其偏好基因编码区， 有效破坏内源基因功能，与传统基因打靶诱变产生类似的表型；利用piggyBac的精 确切离可实现对突变表型的恢复，从而进一步确定表型和基因的对应关系。更为重 要的是，piggyBac转座系统的种属特异性差，除了昆虫外，在哺乳动物细胞、曼氏 血吸虫及疟原虫均表现出较高的转座活性，这为其广泛应用提供了依据。

发明内容

本发明旨在提供一种基于piggyBac转座子的弓形虫基因转移载体，用于弓形虫 药物靶标及疫苗候选抗原的研究鉴定。

本发明还公开了上述载体的制备方法，具有构建简单、转化效率高的特点。

本发明提供的基于piggyBac转座子的弓形虫基因转移载体，其特征在于：包含 piggyBac转座子表达载体及表达piggyBac转座酶的辅助质粒。

所述的弓形虫基因转移载体，其特征在于：弓形虫基因转移载体的piggyBac转 座子表达载体为piggyBac转座子的反向重复序列，弓形虫特异性表达蛋白的调控元 件。

所述的弓形虫基因转移载体，其特征在于：辅助质粒为弓形虫特异性表达蛋白 调控元件指导下表达piggyBac转座酶。