[发明专利]一种提取狂犬病病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用生物技术提取狂犬病病毒的方法。

背景技术

目前狂犬病病毒疫苗的提取一般采用分子筛凝胶层析单一手段，存在以下缺陷：

1)不同批次间质量指标差异较大，对生物制品的稳定性影响较大。

2)残余DNA的去除成为难题。

3)残余宿主蛋白含量过高，临床表现副作用较大。

4)原液制备后抗原含量浮动范围宽，后期成品配制造成一定障碍。

5)影响了生物制品的产品质量，制约了工业化生产提取的规模。

为此许多人尝试在分子筛层析中，对上样液性质，即病毒收获液浓缩倍数，进行调节；对上样体积进行调节；对平衡液进行选择，对平衡液盐浓度进行调节，对平衡液PH值进行控制；层析流速进行控制等手段。仅能轻微的改善结果，技术上没有突破。

李福安等提到，狂犬病毒分子量大于病毒培养液中的杂蛋白分子量。病毒颗粒最先被洗脱下来，在样品蛋白浓度较小时，病毒与杂蛋白可以被分开。但当样品蛋白浓度大于40mg/mL，由于浓度过大使液体粘度增高，扩散速度降低，使正常的凝胶柱层析交换规律受阻，造成液流图形不规则，形成了扩散较大的区带，病毒尚未完全流出凝胶柱，后面的杂蛋白分子已追上来，致使纯化效果不佳。因此，单一用凝胶柱层析法纯化Vero细胞狂犬病疫苗，样品蛋白浓度应在40mg/mL以下。并且上样体积小于柱床体积的5％，由于蛋白浓度的限制产生了瓶颈，制约了生产规模。同时存在残余DNA超标的问题。

张磊等提及，曾采用过硫酸鱼精蛋白直接结合残余细胞DNA的方法，将浓缩了30倍的疫苗原液经硫酸鱼精蛋白一琼脂糖凝胶层析，收获穿透峰后，再用pH3.5醋酸缓冲液洗脱，发现硫酸鱼精蛋白在结合DNA的同时也结合了部分病毒糖蛋白，造成了较大的活性损失，合并穿透峰和洗脱峰，pH调至中性。但是层析填料价格较贵，不能用于工业化生产，并且抗原损失较大需要进行回收处理，同时抗原的稳定性需要进行考察。总之在纯化过程中尽可能提高收率是纯化工艺需要解决的重要经济问题。

发明内容

为克服上述诸多不足，本发明的目的在于提供一种用中空纤维超滤柱、离子交换层析、分子筛凝胶层析相结合和组合的方法提取狂犬病病毒。

本发明的目的是这样实现的：

1、利用截留分子量为750KD或500KD的中空纤维超滤柱或超滤膜将病毒收获液进行浓缩和部分杂质去除；

2、利用阴离子交换层析或分子筛凝胶层析对步骤1所得样品进行分离提纯；

3、利用分子筛凝胶层析或阴离子交换层析对步骤2所得样品进行分离提纯。

利用750KD或500KD中空纤维超滤柱对病毒收获液进行浓缩存在许多优点。病毒浓缩速度比传统的300KD或100KD膜包快，提高了处理效率。单位膜面积相对的处理量增加了许多，批处理量有所增加。从膜截留分子量的选择看，750KD比300KD杂质去除效果要好，并且抗原没有泄漏。

离子交换层析与分子筛凝胶层组合后，生产流程更加合理化，批次稳定性好，HCP的去除效率更高，尤其对残余DNA的去除效果更佳。并且原液制备后抗原含量波动更小，对后续的成品的配制更加方便。

本发明的创新之处在于，病毒的浓缩采用750KD或500KD截留分子量的中空纤维超滤柱，后期的提取工艺增加了离子交换层析步骤，减轻原有单一层析工艺负担，打破了生产的瓶颈，提高了产品质量，在去除残余DNA、HCP上尤其突出。

附图说明

下面结合实施例及附图进一步说明本发明。

图1是电泳检测图谱。

图2是离子交换层析图谱。

图3是分子筛层析图谱。

图4是残余DNA含量检测图谱。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。本实施例仅采用常规实验技术，这些均是本技术领域人员所熟悉的。或者按照试剂生产商所提供的说明书进行。

实施例一

1用截留分子量为750KD或500KD的中空纤维超滤柱对病毒收获液进行浓缩和部分杂质的去除