[发明专利]用于制备检测DNA甲基化试样的试样处理液和试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及一种用于制备检测DNA甲基化试样的试样处理液和试剂盒。也就是说，本发明涉及一种使用该试样处理液和试剂盒的试样制备方法和DNA甲基化检测方法。

背景技术：

在高等真核生物的染色体DNA中，有时在构成DNA的碱基中，C(胞核嘧啶)5端受到甲基化修饰。高等真核生物中的DNA甲基化与原核生物不同，作为遗传信息的表达抑制机构发挥着功能。比如当含有大量某种基因的CpG区域(CpG岛、CG岛)甲基化时，其基因的转录受到抑制。相反，当CpG岛没有甲基化时，转录基因可结合到启动子区，基因处于可转录状态。如此，DNA甲基化是基因表达的调控机构之一，对早期胚胎发育、组织变异的基因表达、哺乳动物特有现象的基因印记和X染色体失活、染色体稳定化、DNA复制的时机等种种生理和病理现象起着重要作用。近年来，人们越来越明白，这种DNA的甲基化强烈地干预癌症和其他疾病。

作为DNA甲基化的分析方法，一般都使用甲基化特异PCR(Methylation specific Polymerase Chain Reaction、以下称“MS-PCR”)。(James G.HERMAN et al.，Methylation-speCifiCPCR：A novel PCR assay for methylation status of CpG islands，ProC.Natl.ACad.SCi.USA，Vol.93，pp.9821-9826，September 1996)。过去使用的这种方法(以下称“标准法”)分四个步骤进行：

1)从生物样本中提取基因组DNA(约3小时)

2)用重亚硫酸盐修饰提取的基因组DNA(约16小时)

3)纯化修饰的基因组DNA(约1小时)，及

4)PCR反应(约2小时)

如此，标准法非常费时(合计约22小时)。问题是尤其PCR反应之前的生物样本的前处理(制备DNA甲基化检测用试样)很复杂，仅前处理(上述1～3)就需要约20小时。

为了缩短长时间的前处理时间，有人提议用高浓度重亚硫酸盐进行上述2)的重亚硫酸盐修饰(Masahiko SHIRAISHI and HikoyaHAYATSU，High-Speed Conversion of Cytosine to UraCil inBisulfite GenomiC SequenCing Analysis of DNA Methylation，DNARESEARCH 11，409-415(2004))。用此方法(以下称“快速法”)的话，用标准法约需16小时，用重亚硫酸盐修饰只需20分钟即可。因此，前处理时间从约20小时缩短为约4小时。然而，用此快速法前处理也要约4小时。

日本专利公开第2005-058217号公报公开了一种甲基化DNA检测方法，是用含有异硫氰酸胍、碘化钠、尿素和SDS等蛋白质变性剂的溶液溶解微量的细胞标本，用上述标准法的重亚硫酸盐处理液处理。

发明内容：

本发明的范围只由后附权利要求书所规定，在任何程度上都不受这一节发明内容的陈述所限。

本发明人等发现专利公开第2005-058217号公报上公开的方法有以下几个问题：

1)当生物样本蛋白质含量多时，DNA甲基化的检测结果不稳定；

2)使用高浓度重亚硫酸盐的快速法，因进行重亚硫酸盐处理的试样的蛋白质会发生盐析，故检测结果也不稳定。

因此，本发明的目的是提供一种用于制备DNA甲基化检测用试样的试样处理液和试剂盒、使用该试样处理液和该试剂盒的试样制备方法和DNA甲基化检测方法，这种方法可以在DNA甲基化检测中得出稳定的检测结果，并且前处理简便易行。

本发明人发现，用含有蛋白酶和水性溶剂的试样处理液处理生物样本，可以获得稳定的DNA甲基化检测结果，从而完成了本项发明。

即，本发明提供：

一种用来制备DNA检测用试样的试样处理液，其特征在于：所述试样处理液含有蛋白酶和水性溶剂。

所述的试样处理液还含有表面活性剂和/或离液剂。

所述的试样处理液的表面活性剂是选自十二烷基硫酸钠、十四烷硫酸钠、十二(烷)磺酸钠、十四烷磺酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠和牛磺脱氧胆酸钠中的至少一种。

所述的试样处理液的离液剂是选自硫氰酸胍、硫氰酸钠、盐酸胍、碘化钠、碘化钾和尿素中的至少一种。

所述的试样处理液中还含有可以切断DNA的切断剂。

所述的试样处理液，其pH值为7～10。