[发明专利]通过低pH和二价阳离子分离生物大分子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及在组合物中分离生物大分子的方法。特别地，本 发明涉及在包含杂质的组合物中分离生物大分子的方法，该方法包括(a) 降低该组合物的pH，(b)向该组合物添加二价阳离子，以及(c)把该生物大 分子与该杂质相分离。

背景技术

生物大分子(如重组生物大分子)在多种技术中具有重要意 义。传统上，已采用了许多不同的方法来纯化生物大分子，举例而言，例 如，过滤、离心、尺寸排阻层析、亲和层析或上述方法的组合。纯化方法 的选择通常基于该生物大分子和组合物中与该生物大分子共存的一种或 多种杂质的区别特征。大量的生物大分子具有商业意义，对于能够及时和 低成本纯化大量生物大分子的能力存在着需求。已进行了广泛的研究来提 高目前的纯化生物大分子的纯化技术和方法的效率。适用于小规模制备的 纯化技术通常不适用于工业规模纯化。

具有商业重要性的生物大分子包括，例如，蛋白和核酸，例 如，DNA和RNA。常以工业规模进行分离的生物大分子的两种范例是单 克隆抗体和融合蛋白。这些抗体和融合蛋白在多种诊断和治疗领域具有价 值，并被用于治疗各种疾病，例如，遗传和获得性免疫缺陷疾病和感染疾 病。

生产纯化抗体的传统方法包括硫酸铵沉淀，使用辛酸后离 心，离子交换层析(例如，DEAE或羟基磷灰石)，免疫亲和纯化(例如， 蛋白A和蛋白G)，以及透析。例如，参见Antibodies：A Laboratory Manual， Harlow和Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)。上述方法的联合使 用非常常见，例如，使用乙醇进行组分分离(fractionation)后进行离子交换 层析和/或辛酸(CA)沉淀从血浆纯化抗体。例如，可参见McKinney等人， J.Immuno1.Methods 96：271-278(1987)；美国专利4,164,495、4,177,188、 RE 31,268、4,939,176和5,164,487。此外，发酵中的酸化已被用于提高抗 体和重组蛋白的回收率和稳定性。例如，参见Lydersen等人，Annals New  York Academy of Sciences 745：222-31(1994)。

已开发了多种其它方法来分离和/或纯化抗体，其中包括了 酸沉淀的应用。例如，参见美国专利7,038,017、7,064,191、6,846,410、 5,429,746、5,151,504、5,110,913、4,933,435、4,841,024和4,801,687。然 而，这些方法中有许多可导致在工业规模生产抗体时大的原料量和回收损 失和/或高成本。对于(特别是在进行切向流过滤中)通过调节收获条件来 提高细胞澄清稳健性的效果上进行的工作还非常有限。

从含有哺乳动物或细菌细胞的工业规模生物反应器中收获 抗体和重组蛋白通常采用过滤或离心。然而，在采用这些技术时，核酸(例 如，DNA)、宿主细胞(HCP)和生长培养基成分通常不能与该目标生物大 分子充分分离。最近在细胞培养中提高蛋白生产数量的需求使得生物反应 器需要在更高的细胞密度下运行，这从而提高了杂质(例如DNA、HCP 和其它培养基成分)的数量。污染物水平的上升对细胞收获操作(例如， 过滤和离心步骤)以及下游纯化步骤(例如，层析和透析步骤)提出了更 高的要求。更高水平的杂质的添加增加了所需进行的纯化步骤数，从而降 低了总体的生产能力。

作为前述困难和低效的结果，需要提高生物大分子的分离策 略。

发明内容

本发明涉及在包含杂质的组合物中分离生物大分子的方法， 该方法包括(a)降低该组合物的pH，(b)向该组合物添加二价阳离子，以及 (c)把该生物大分子与该杂质相分离。在部分实施方式中，(a)中的降低pH 和(b)中的添加二价阳离子发生在(c)中的分离之前。

生物大分子的分离可通过多种手段实现。在部分实施方式 中，通过过滤所述组合物进行(c)的分离，该过滤形成渗透流(permeate  stream)和滞留流(retentate stream)。在使用过滤的部分实施方式中，该生物 大分子基本在渗透流中，而在部分实施方式中，通过切向流过滤器进行该 过滤。在其它实施方式中，通过离心该组合物进行(c)中的分离，该分离形 成上清液和沉淀物。在使用过滤的部分实施方式中，该生物大分子基本在 上清液中。