[发明专利]检测和/或定量细胞中靶蛋白候选物的表达的方法和鉴定小分子调节剂的靶蛋白的方法

权利要求书

1.检测和/或定量细胞中靶蛋白候选物表达的方法，包括步骤：

-向载体中导入编码标记蛋白的第一个核酸，

-向所述载体中导入编码要检测和/或定量其表达的所述靶蛋白候 选物的第二个核酸，从而使得所述第一个和第二个核酸可操作地连接， 从而使得所述标记蛋白的表达指示所述靶蛋白候选物的表达，

-向细胞中导入所述载体，

-检测和/或定量所述标记蛋白的表达，

-将所述标记蛋白的表达与所述靶蛋白候选物的表达联系起来，且 由此检测和/或定量所述靶蛋白候选物的表达。

2.根据权利要求1的方法，其中所述第一个和第二个核酸通过下面 的排列之一在所述载体内可操作地连接：

a)所述第一个核酸处于第一个启动子的控制下，且所述第二个核酸 处于第二个启动子的控制下，所述第二个启动子与所述第一个启动子的 位置分开，并且所述第一个和第二个启动子序列相同或者具有相同的活 性，

b)所述第一个核酸处于第一个启动子的控制下，且所述第二个核酸 处于第二个启动子的控制下，所述第二个启动子与所述第一个启动子的 位置分开，并且所述第一个和第二个启动子序列不同，且每个所述启动 子的活性是可预测的，

c)所述第一个和所述第二个核酸处于单个启动子的控制下，并且所 述第一个和所述第二个核酸通过含有内部核糖体进入位点(IRES)的一段 核苷酸相互分开。

3.根据前面权利要求任一项的方法，其中所述标记蛋白是荧光蛋 白、抗体的片段、表位、酶、抗生物素蛋白、肽生物素模拟物、通过直 接结合可被检测的肽或者通过与含有化学荧光团或者类似结构的有机 分子化学结合或反应从而使得产生光学上可检测信号而被检测的肽。

4.根据权利要求2-3任一项的方法，其中所述IRES选自来自病 毒的IRES、来自细胞mRNAs的IRES，尤其来自如下病毒的IRES：小 RNA病毒，如脊髓灰质炎病毒、EMCV和FMDV，黄病毒属，如丙型 肝炎病毒(HCV)，瘟病毒属，如经典猪瘟病毒(CSFV)，反转录病毒，如 鼠白血病病毒(MLV)，慢病毒，如猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，和昆虫 RNA病毒，如蟋蟀麻痹病毒(CRPV)，和来自细胞mRNA的IRES，所述 mRNA如翻译起始因子，如eIF4G，和DAP5，转录因子，如c-Myc，和 NF-κB-抑制因子(NRF)，生长因子，如血管内皮生长因子(VEGF)，成纤 维细胞生长因子2(FGF-2)，血小板衍生生长因子B(PDGF-B)，同源异形 基因，如触角足，存活蛋白，如细胞凋亡的X连锁的抑制剂(XIAP)，和 Apaf-1，和其他细胞mRNA，如BiP。

5.根据权利要求2-4任一项的方法，其中

-如果所述第一个和第二个启动子序列相同，那么它们选自包含 CMV、EF1、SV40、人H1和U6启动子的组，

-如果所述第一个和第二个启动子具有相同活性，那么它们每个独 立地选自包含CMV、EF1、SV40、人H1和U6启动子的组，

-如果所述第一个和第二个启动子序列不同并且所述启动子的活性 是可预测的，那么每个所述启动子独立地选自包含CMV、EF1、SV40、 人H1和U6启动子的组，

-所述单个启动子选自包含CMV、EF1、SV40、人H1和U6启动 子的组，并且所述IRES选自具有选自包含SEQ ID NO：1-15的组的序列 的核酸。

6.根据前面权利要求任一项的方法，其中通过转化、转染、电穿孔、 病毒转导、转导、冲击递送将所述载体导入所述细胞中。

7.根据前面权利要求任一项的方法，其中通过能够定量测量的任一 种光学检测方法，尤其具有空间分辨率的光学检测、显微术、荧光激活 细胞分选、UV-Vis光谱测定法、荧光或磷光测量、生物发光测量进行 所述检测和/或定量。