[发明专利]分离和检测小多核苷酸的方法和物质

权利要求书

1.包含多核苷酸的捕获探针，所述多核苷酸由以下组成：

由间隔区段序列组成的间隔区段，该间隔区段具有3’端和5’端；

由模板区段序列组成的模板区段，该模板区段具有3’端和5’端；以 及

由小多核苷酸结合区段序列组成的小多核苷酸结合区段；以及任选 地，

能结合于固相的分子组合物的固相结合区段；

其中所述小多核苷酸结合区段通过沃森-克里克碱基配对与一个或多 个目的小多核苷酸基本上互补并能与其杂交，其中所述目的小多核苷酸 选自RNA多核苷酸、DNA多核苷酸和其组合；

其中所述间隔区段的5’端与所述小多核苷酸结合区段的3’端连接； 且

其中所述模板区段的3’端与所述小多核苷酸结合区段的5’端连接。

2.如权利要求1所述的捕获探针，其中所述间隔区段包括RNA聚合 酶终止位点。

3.如权利要求1所述的捕获探针，其中所述小多核苷酸结合区段与 目的miRNA基本上互补且能与其杂交。

4.如权利要求1所述的捕获探针，其中所述模板区段包括选自下述 的一个或多个序列：

(a)多核苷酸聚合酶识别位点或与多核苷酸聚合酶识别位点互补的 序列；

(b)为限制酶识别基序的一个或多个序列；以及

(c)与RNA切割催化核酸互补的一个或多个序列。

5.包含权利要求1所述的两种或多种捕获探针的组合物，所述组合 物包含：

(a)具有第一间隔区段、第一小多核苷酸结合区段和第一模板区段的 第一捕获探针；以及

(b)具有第二间隔区段、第二小多核苷酸结合区段和第二模板区段的 第二捕获探针，其中所述第二小多核苷酸区段与所述第一多核苷酸结合 区段具有不同的多核苷酸结合区段序列，并且所述第二模板区段与所述 第一模板区段具有不同的模板区段序列。

6.分离目的小多核苷酸的方法，其包括：

(a)提供权利要求1所述的一种或多种捕获探针；

(b)提供包含目的小多核苷酸的样品，其中所述目的小多核苷酸选自 miRNAs、snoRNAs、siRNAs或短干扰RNAs；

(c)将所述捕获探针与所述样品合并；

(d)将所述目的小多核苷酸与所述捕获探针的小多核苷酸结合区段 杂交以形成小多核苷酸/捕获探针复合物；

(e)将所述小多核苷酸/捕获探针复合物与能够用RNA作为引物的多 核苷酸聚合酶和一组三磷酸核苷酸合并；以及

(f)延伸所述杂交的目的小多核苷酸以形成延伸产物，所述延伸产物 包括在3’端与延伸的区段连接的所述目的小多核苷酸、含有与所述捕获 探针的模板区段互补的序列的延伸的序列，其中所述延伸产物与所述捕 获探针杂交以形成延伸产物/捕获探针复合物。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述目的小多核苷酸是miRNA。

8.如权利要求6所述的方法，其中所述捕获探针还包含固相结合区 段，并且通过将捕获探针经由所述固相结合区段结合到固体载体上，将 所述小多核苷酸/捕获探针复合物或所述延伸产物/捕获探针复合物捕获 到固相。

9.从样品中检测目的小多核苷酸的方法，所述方法包括：

(a)依照权利要求6所述的方法分离目的小多核苷酸，其中所述捕获 探针附着于荧光珠上，且所述延伸的区段包含一个或多个标记的核苷酸 残基；以及

(b)检测所述荧光珠和与捕获延伸探针杂交的标记的延伸产物。

10.检测目的小多核苷酸的方法，其包括：

(a)依照权利要求6所述的方法分离目的小多核苷酸，其中所述捕获 探针的模板区段包含RNA聚合酶识别序列的一条链，且延伸步骤形成双 链RNA聚合酶启动子；

(b)将所述延伸产物/捕获探针复合物与识别双链RNA聚合酶启动子 的RNA聚合酶合并；

(c)转录启动子下游的序列以合成包含小多核苷酸结合序列的单链 RNA产物。