[发明专利]重组或转基因因子VII合成物,每个因子VII分子有两个带有定义了聚糖单元的N-糖基化位点

说明书

技术领域

本发明涉及一种以因子VII合成物形式获得的重组的或转基因的因子VII， 因子VII的每个分子具有两个带有所定义聚糖部分的N-糖基化位点，以及其 作为药物的使用。

背景技术

因子VII(FVII)是一种依赖于维他命K的糖蛋白，在其活化形态(FVIIa) 下参与凝血过程，在存在钙和组织因子的情况下活化因子X和因子IX。FVII 以具有406个氨基酸残基的单肽链形态分泌，其分子量约为50kDa。FVII包含 四个特别的结构域：N端γ-羧基域(Gla)，两个“类表皮生长因子(EGF)”域， 以及丝氨酸蛋白酶域。将FVII活化为FVIIa是以精氨酸₁₅₂-异亮氨酸₁₅₃域(精 氨酸152-异亮氨酸153)连接的裂解为特征的。因此，FVIIa是具有分子量约 为20kDa，具有152个氨基酸的轻链，和分子量约为30kDa，具有254个氨基 酸的重链的化合物，两条链通过单二硫键相互连接(半胱氨酸₁₃₅-半胱氨酸 ₂₆₂)。

血浆FVIIa包含几种翻译后修饰：前十个谷氨酸是γ-羧基化的，天冬酰胺 ₆₃部分羟化，丝氨酸₅₂(丝氨酸52)和丝氨酸₆₀(丝氨酸60)被氧-糖基化， 并携带葡萄糖(木糖)_0-2和岩藻糖模型，分别地，天冬酰胺₁₄₅(天冬酰胺145) 和天冬酰胺₃₂₂(天冬酰胺322)主要通过二天线的二唾液酸化(bisialylated) 的复合结构而N-糖基化。

FVII是用于治疗血友病病人的，表现为因子VIII(A型血友病)或因子IX (B型血友病)的缺失，对于病人表现出凝血因子的其他缺失，例如，FVII的 先天性缺失。因此获得可注射的FVIIa浓缩物是必需的。

获取FVIIa浓缩物的最古老的方法包含从血浆蛋白质中提纯由分馏所产生 的FVIIa。

出于那个目的，文件EP0346241描述了FVIIa富集部分的制备，其在吸附 后获得，接着洗提血浆蛋白质分馏第二产物，其包含FVII和FVIIa以及其他蛋 白质，例如因子IX(FIX)，X(FX)和II(FII)，尤其是PPSB(P＝凝血素或 FII，P＝转变加速因子前体或FVII，S＝司徒(Stuart)因子或FX，以及B＝抗 血友病因子B或FIX)的预洗提液。这种方法的缺点是获取的FVII仍然含有痕 量的其他凝血因子。

同样的，文件EP0547932描述了基本上无维他命K依赖因子的高纯度FVIIa 浓缩物和FVIII的制造方法。通过这种过程获得的FVII，不管其纯度，仍表现 出残留的凝血酶原活性。

这样一来，这些方法的主要缺点之一是它们只产生少量的产品。此外，还 难以获得完全无血浆中存在的其他蛋白质的产品。最后，虽然已在制备血浆凝 血因子的每个阶段都采取了一系列措施来保证其病毒和细菌安全性(追踪献血 者，为探测已知病毒性和细菌性污染物进行测试，严格纯化以及病毒失活处理 来尽量减少血液起源的病原体的危害)，然而，病原体污染的风险并没有完全被 排除。另外，克-雅病新变体的出现引发了对通过血液产品中非传统病原体传 播的恐惧。而且，从献血者那所获得血浆的体积仍然受限。

因此，自从二十世纪八十年代，编码人体因子VII的DNA被分离(Hagen et al.(1986)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA；Apr 83(8)：2412-6)，并在哺乳动物BHK细 胞(幼仓鼠肾)中进行表达(文件EP0200421)。即使这种制造FVII的方法具 有控制感兴趣蛋白质生产媒介的优势，已知仓鼠细胞告知了其表达的 Galα1，3Gal部分的蛋白质(Spiro RG et al，J.Biol.Chem，1984，vol.259，N°15， 9858 and Furukawa K.et al.，J.Biol.Chem，1992，vol.267，N°12，8012)，其免疫原 性已经被证实。