[发明专利]鸟类端粒酶反转录酶

说明书

本发明特别地涉及新的重组端粒酶反转录酶、编码它们的核酸分 子、包含所述的核酸分子的细胞以及这些细胞用于生产所需的物质的 用途。

在1965年，L，Hayflick发现细胞具有程序性死亡时刻。作为衰老 的一种解释，他提出人类细胞可以分裂的次数是有限的(Exp Cell Res， 1965 Mar；37：614-36)。现在，这被认为是由端粒在细胞分裂时缩短引 起的。染色体被由保守的、衔接重复的、非编码的，六聚体DNA序列 组成的并和单链及双链接和蛋白连接的端粒盖帽。端粒负责基因组稳 定性功能，特别是染色体末端的复制。成功的染色体末端复制同时依 赖于独特的端粒结构和专门的酶端粒酶反转录酶，其为一种具有反转 录酶酶活性的核蛋白质。端粒酶反转录酶能延长端粒重复阵列，允许 互补子链的延长复制。在缺少端粒酶反转录酶的细胞中，端粒DNA在 连续分裂中缩短，因为一旦起始RNA引物被除去后，DNA合成酶不 能完全复制染色体的末端。许多研究报道了所谓的“端粒钟”是一个 人类细胞寿命的重要特征。细胞衰老的端粒假说提出端粒的缩短与端 粒酶反转录酶剩余活性的缺少有关，并引起染色体不稳定性，导致衰 老、凋亡相关。端粒酶反转录酶活性在体内发育期间在体细胞谱系中 和在与体外端粒缩短相关的原代细胞中下调。相反，端粒酶反转录酶 活性的上调或紊乱发生在转化细胞和肿瘤中。克隆和研究了来自几种 哺乳动物和一种两栖动物的端粒酶反转录酶(TERT)cDNA(Nakamura 等人，1997，Science 277，955-959；Greenberg等人，1998，Oncogene 16，1723-1730)。

因为TERT在细胞中的过表达会引起所述的细胞无限增殖，人们 提出了TERT用于产生细胞系的用途(McSharry等人，2001 J Gen Virol， 82，855-63)。然而，TERT的活性是受物种限制的。例如，人类的TERT 和鸟的端粒维持装置是不相容的(Michailidis等人，2005，Biochem Biophys Res Commun，335(1)，240-6)。因此，为了研究鸟类和更多 特别是鸭科细胞系，需要可在这些特定细胞中执行功能的TERT。

真核细胞系是用于制备病毒疫苗和许多生物技术产品的基础。在 细胞培养中产生的生物制品包括酶、激素、免疫生物制品(单克隆抗 体、白细胞介素、淋巴因子)和抗癌剂。尽管许多较简单的蛋白可以 使用细菌细胞生成，更复杂的糖基化蛋白目前必须在真核细胞中制备。

鸟类细胞系特别有用，因为在药物合成中所用的许多病毒能够在 其中复制。更值得注意的是，多种病毒只能在鸟类细胞中生长。例如 修饰的安卡拉病毒(Modified Virus Ankara，MVA)，其不能在大多数 哺乳动物细胞中生长。七十年代早期，这个来源于痘苗病毒通过超过 500次在CEF中传代的痘病毒就被用于预防接种免疫缺陷型人群以抗 天花。现在，MVA主要用作基因治疗和免疫治疗目的的载体。例如， MVA用作MUCI基因的载体，用于预防接种患者以抗表达该抗原的肿 瘤(Scholl等人，2003，J Biomed Biotechnol，2003，3，194-201)。载 有编码HPV抗原基因的MVA还被用作高度宫颈损伤治疗性处理的载 体。近来，MVA已成为用于制备对新出现疾病的预防性处理剂或可能 的生物武器比如西尼罗河病毒和炭疽的备选载体。

因此，需要一种新的能无限增殖鸟类细胞特别是鸭科细胞的端粒 酶反转录酶。

在整个申请中使用的“一个(种)”意思是“至少一个(种)”、“至 少第一个(种)”、“一个(种)或多个(种)”或“多个(种)”所提及 的组分或步骤，除非内容另有清楚地规定。例如，“一个细胞”包括多 个细胞，包括其混合物。

本文中任何部分所用的“和/或”包括含义“和”、“或”和“所 有由该词语连接的要素的所有或任何其他的组合”。

本文使用的“包括”和“包含”指产品、组合物和方法包括提及 组分或步骤，但并不排除其他的。当使用“基本上由……组成”来定 义产品、组合物和方法时，是指排除其他任何具有实质意义的组分或 步骤。因此，基本上由所述的组分组成的组合物并不排除痕量污染物 和药用载体。“由……组成”指排除高于痕量的其他组分或步骤。