[发明专利]一种使用混合吸附色谱分离纯化贻贝粘蛋白的方法

权利要求书

1.一种使用混合吸附色谱分离纯化贻贝粘蛋白的方法，其特征在于：该方法的步骤为：

1)以1％高氯酸为提取溶剂，100g贻贝足丝加300ml提取溶剂，15℃浸提15min，使用搅拌器将冷冻的贻贝足丝高速打碎使其均匀悬浮于提取溶剂中；

2)以45μm滤膜过滤去除残渣，保留上清；

3)用Sephadex G-25去除小分子化合物，流动相为pH 3.0的30mM的醋酸钠缓冲液，添加0.2M氯化钠，收集穿透峰；

4)以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓缩馏分；

5)采用Superose 12pg，柱体积50ml，洗脱液包括0.2M氯化钠，300ml，乙酸0-20％梯度洗脱；

6)以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓缩馏分；

7)用3％的柠檬酸4℃透析，4℃保存；

8)从分子量的角度鉴定贻贝粘蛋白：采用15％浓度的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，20℃染色2h，以高分子量标准蛋白质标记，确认目标蛋白质分子量为130kD；

9)四氮唑蓝特异性染色鉴定贻贝粘蛋白：采用12.5％浓度的乙酸-尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色液采用pH值为10的四氮唑蓝-氨基乙酸溶液，20℃染色1.5h，贻贝粘蛋白将被特异性显色；

10)用C8反相键合相硅胶色谱柱分析贻贝粘蛋白纯度：C8色谱柱4.6×250mm，5μm，以乙腈-水为流动相等度洗脱，280nm检测，其中，乙腈和水的比例为15∶85。