[发明专利]实时定量PCR检测细胞周期蛋白B2基因表达的方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学肿瘤学领域。具体地说，本发明涉及一种新的检测血液尤其是血清中细胞周期蛋白B2基因表达的方法及其试剂盒。 

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康的重要疾病，目前全球每年至少有700万人死于恶性肿瘤，其中我国约130万，恶性肿瘤已成为继心脑血管病之后人类因疾病死亡的第二位原因。恶性肿瘤中90％以上属于上皮来源的实体肿瘤(俗称癌症，如肺癌、肝癌、胃癌等)，这些恶性实体肿瘤(以下简称肿瘤)致死的主要原因是转移，尤其是全身转移。临床观察到，对病理检查无淋巴结转移的早期肿瘤患者，根治性手术后仍有相当一部分因全身转移而最终死亡，提示在手术时体内已经存在少量癌细胞全身播散但应用现有的诊断手段(如影像学和核医学等)尚无法发现，这类隐匿性的转移(Occult Metastasis，或称微转移，Micrometastasis)是患者术后肿瘤复发转移的一个重要根源⁽¹⁾。 

动物实验揭示，当瘤重达到1克(直径1cm)时，每天约有10⁶癌细胞从原发肿瘤脱落进入血液，这些癌细胞在血液中很少死亡，它们通过血液循环转运到各器官后很快穿越血管内皮屏障进入组织，其中98％的癌细胞在组织内凋亡并被机体清除，但仍有2％的癌细胞存活下来并发展成为转移病灶⁽²⁾。德国学者曾对骨髓中的微转移癌细胞进行培养，证明此类癌细胞能够在体外生长，并且癌细胞活跃生长者生存期短。因此，血液中出现癌细胞是肿瘤转移的一项早期预警指标，预示转移的风险增高。建立肿瘤转移的早期预警系统在临床上具有广泛的应用价值，因为该系统不仅有助于对患者进行预后评估，而且更重要的是可以对术后转移进行早期诊断和及时治疗，以期巩固疗效和改善预后。此外，检测血液中癌细胞还可以作为评估晚期肿瘤化疗疗 效的一项分子标志。文献报道，化疗后血液中癌细胞消失者预后好、生存期长^(2，3)。 

几乎所有肿瘤都有一个根本的共同特征：细胞周期调控机制的破坏导致细胞的失控性生长。细胞周期蛋白是细胞周期调控的作用蛋白，它可大致分成两大类：G1周期素(G1 cyclins或START cyclins)及分裂期周期素(mitotic cyclins)。在哺乳类动物中，G1周期素有周期素D及E二种，而分裂期周期素包括周期素A和B1、B2，它们在整个间期中相当稳定，但在有丝分裂时却被迅速而特异地降解。在启动有丝分裂中周期素A和B起重要的协同作用，一旦进入有丝分裂期，周期素B将成为最重要的。它在有丝分裂的中期-后期过渡处降解；是完成有丝分裂所必需的。细胞周期蛋白B2是细胞周期依赖合成的。它与细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶1(cdc2)相连接形成一个复合物，这一复合物对于细胞有丝分裂有正向调节的作用，对于细胞进行有丝分裂是关键的^(4，5)。三氧化二砷(As₂O₃)是一种致癌剂可以促进细胞增殖诱导肿瘤的发生，但在体外实验上存在剂量效应外推的不确定性。细胞周期蛋白B2在G2期有最大的表达，且受转录水平的调节⁽⁶⁾，在肺癌、乳腺癌等肿瘤中表达增高，可被认为是一种较好的血清诊断标志物。 

因此近十年来从血液中检测肿瘤标记物受到了国内外学者的普遍关注⁽⁸⁾。随着现代免疫学和分子生物学技术的发展，目前已经能够对血液中的微量肿瘤标记物的mRNA进行检测，表1列举了近年来对6种常见肿瘤患者血液的肿瘤标记物检测的若干结果，报道中有6篇附有2年以上的随访结果，证明血液中检出癌细胞与患者预后呈负相关。根据北京市肿瘤研究所的最新统计资料，这些肿瘤的发病率居北京市区恶性肿瘤的前10位，占恶性肿瘤总发病率的70％以上。 

表1恶性实体肿瘤患者血液中肿瘤标记物检测结果 

注：CEA：癌胚抗原；CK：细胞角蛋白；S5A：肺癌特异性单抗识别的抗原；MAGE：黑色素瘤抗原；EPCAM：上皮细胞粘附分子；RT-PCR：逆转录-聚合酶链反应；FCM：流式细胞仪检测；IHC：免疫组化。 

目前从血液中检测肿瘤标记物的技术还不完善，存在许多问题，一是检测方法不统一，包括各家采用的检测技术和肿瘤标志不一致，研究结果很难相互比较：二是敏感性较低，可能会有一部分患者漏诊；三是大部分肿瘤标志基因在正常白细胞中有“非法表达”(Illegitimate Expression)现象，如采用RT-PCR检测CK-19mRNA在一部分健康人外周血中可能出现“假阳性”⁽¹⁰⁾。