[发明专利]重组人白细胞介素-11的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明提供了一种高效生产重组人白细胞介素-11(Recombinant Human Interleukin 11，IL-11)的方法，以及有关的序列优化、表达载体及工程细胞的构建。

背景技术

白细胞介素-11(IL-11)主要由间充质来源的粘附细胞(mesenchymal-derived adherent cell)产生，如骨髓基质细胞、基质成纤维细胞、人胚肺成纤维细胞和滋养层细胞。IL-11是一种促血小板生长因子，可直接刺激造血干细胞和巨核祖细胞的增殖，诱导巨核细胞的成熟分化，增加体内血小板的生成，而血小板功能无明显改变。IL-11是人类生长因子家族成员，该家族成员包括生长激素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)以及其他生长因子等。

人IL-11基因定位于19号染色体长臂13区(19q13.3-q13.4)，含有5个外显子和4个内含子，长约7Kb。人IL-11基因5′端有多个潜在的转录调控序列，如TATA盒样序列(TATATAA)和AP-1位点(5′GGTGAGTCAG3′)，

其3′端在5591和6762个核苷酸处各有一个聚腺苷酸化位点，为此可形成1.5kb和2.5kb的mRNA转录物。人IL-11cDNA含597个bp的单一长开放读码框，编码199个氨基酸的多肽，其中N端21个氨基酸为导肽，成熟蛋白为178个氨基酸组成，理论分子量19.144KD，不含半胱氨酸残基，亦无潜在的糖基化位点。

近年来，随着对IL-11体内外调控作用及分子生物学研究的不断深入，人们认识到IL-11是一个多功能的细胞因子，具有广泛的细胞生物学活性。最初发现它能刺激IL-6依赖的鼠浆细胞瘤细胞系T1165的增殖。这也是基因工程重组IL-11体外测活方法的依据。另外，IL-11对造血系统的作用非常广泛，主要表现为与其他造血因子协同，对各系造血均有不同程度的促进作用。国内外新近研究发现，IL-11除最常见的造血活性外，还具有免疫调节、抗感染和保护黏膜上皮等功能。

人体内的IL-11能刺激原始造血干细胞的生长，并能诱导巨核细胞前体细胞的分化和成熟，促进巨核细胞和血小板生成，增加体内血小板数量并保持其功能。这一家族的共同特点是使用gp130作为信号转导蛋白。从而发挥其药效学作用，白介素-11的生物学作用主要有以下几点：

1、促进原始祖细胞的增殖IL-11与IL-3、IL-4、SCF和GM-CSF等可发挥协同作用，可刺激多能造血干细胞、多能定向干细胞和单能定向干细胞增殖，可促使这些细胞从G0期进入活性周期，缩短了细胞周期。

2、促进巨核细胞和血小板的生成IL-11对巨核细胞和血小板生成的不同阶段都有刺激作用，不仅可以使形成的巨核细胞集落数目及大小增加，而且可以提高外周血小板的数量。

3、在各种动物模型中，同时还观察到IL-11的一些非造血系统效应：包括调节肠上皮细胞的生长(促进胃肠道粘膜损伤愈合)，抑制脂质形成，诱导急性期反应蛋白合成，刺激破骨细胞的发育和神经祖细胞的增殖。

自从1990年发现IL-11后，美国Genetics Institute公司就开始了rhIL-11的研究，用基因重组技术将IL-11基因重组到大肠杆菌中进行表达，获得与人体IL-11具有相同活性的重组人白介素-11，共177aa，分子量约19KD，与天然的白介素-11相比仅缺乏N端的脯氨酸，该缺失对体内外生物活性均无影响无糖基化。。1997年11月美国FDA批准了该公司的重组产品上市，商品名为Neumega，用于治疗肿瘤放化疗导致的血小板减少以免于血小板输注。每支为5mg冻干粉，不含人与动物的血源物质，主要添加剂为甘氨酸，用无菌注射用水溶解。皮下给药10～50μg/(kg·d)，患者都能较好耐受。临床研究表明，在高剂量化疗肿瘤患者中应用该公司生产的rhIL-11后，28％的患者避免了血小板输血，而对照组只有3％的患者无需输血小板。

本发明系统提供了一种高效生产重组人IL-11的方法。通过优化编码重组人IL-11的核苷酸序列，采用糖基人源化改造的新型毕赤酵母表达体系分泌表达缺乏N端1个脯氨酸的人IL-11，优化表达载体/宿主菌组合，同时改进发酵工艺，提高重组人IL-11的表达水平。同时简便纯化工艺，获得高表达、高得率、极具产业化价值的一种重组人IL-11生产方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种优化的重组人IL-11蛋白。