[发明专利]一种倍他米松人工抗原的制备方法

说明书

技术领域

一种倍他米松人工抗原的制备方法，属于生物化工领域。

背景技术：

倍他米松(Betamethasone，BET)属人工合成类糖皮质激素，化学名称为16α-甲基-11β，17α，21-三羟基-9α-氟孕甾-1，4-二烯-3，20-二酮。具有抗过敏、抗炎和影响糖代谢的作用，常被用于治疗家畜的炎症反应、免疫性疾病、牛的酮病和羊妊娠毒血症等。倍他米松还常被用作生长促进剂，增加家畜的饲料摄入量从而使其达到增重的目的。然而，经毒理学试验证明，该药物具有至突变性、蓄积毒性，ADI值为0.000015mg/kgbw/day。若随意在饲料中添加该药物，蓄积的药物通过食物链进入人体，将造成巨大的危害。为此许多国家将此类药物列入禁用药物名单。当今国际上常用的倍他米松残留的检测方法有：薄层色谱(TLC)、液相色谱(LC)、气相色谱(GC)、气-质联用法(GC-MS)、液-质联用法(LC-MS)等，但这些仪器分析方法不仅需要昂贵的仪器设备，对检材的要求也比较高，需要经过复杂的样品前处理才能进行。国外早已经开展了对倍他米松免疫分析方法的研究，但国内目前在这方面还是一片空白。为了加强对国内肉制品的监督力度和保障人民的身体健康，有必要展开对倍他米松免疫分析方法的研究，有必要提供一种有效的倍他米松人工抗原的制备方法。

发明内容：

本发明的目的是提供一种倍他米松人工抗原的制备方法，所制备的产品可用于糖皮质激素类免疫方法的研究，为今后人们的研究提供了方便的途径。

本发明的技术方案：一种倍他米松人工抗原的制备方法，以倍他米松为原料，利用丁二酸酐与倍他米松反应生成倍他米松琥珀酸半酯，得到人工半抗原；利用活性酯法使半抗原转变为活性酯中间体，然后使之与牛血清蛋白结合，制备倍他米松的人工抗原即倍他米松-牛血清蛋白。其反应方程式为：

倍他米松                             倍他米松-21-琥珀酸半酯

                             倍他米松-牛血清蛋白

工艺步骤为：

(1)人工半抗原的制备：

倍他米松和丁二酸酐配料摩尔比为1∶3，称取倍他米松0.8mmol和丁二酸酐2.4mmol于50mL圆底烧瓶中，加入5mL无水吡啶，混合物在60℃下加热搅拌反应6h，将反应物转入20mL含10％盐酸的4℃冰水中，有白色沉淀析出，离心除去吡啶及过量的丁二酸酐，滤饼用去离子水洗涤数次，离心，干燥箱干燥后得到倍他米松半抗原，置于4℃保存；

硅胶薄层板的制作：称取硅胶12g，溶解在40mL 0.5％质量浓度的羟甲基纤维素钠溶液中，用玻璃棒充分搅拌成糊状，超声波振荡1分钟，均匀涂布在玻璃板上，置于阴凉处自然干燥后，放入105℃的烘箱中活化1h，最后放入干燥箱中备用；

薄层层析法检测：硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为甲醇∶氯仿∶氨水体积比为21∶78∶1，展开至薄板3.5-4cm处，取板，吹干溶剂，将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.21处观察到显色点作为反应终点；

(2)人工抗原的制备：

制备A液：称取0.09mmol半抗原，0.09mmol N-羟基琥珀酰亚胺，0.099mmolN，N-二环己基碳二亚胺于20mL烧杯中，溶解于1.8mL的二氧六环中，室温下搅拌过夜，离心后弃沉淀，清液为活性酯中间体，为A液；

磷酸盐缓冲液：将0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液94.7mL与0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液5.3mL混合即为pH 8.0的磷酸盐缓冲液；

制备B液：称取120.6mg的牛血清蛋白溶解于9mL的pH 8.0的磷酸盐缓冲液中，4℃低温搅拌半小时，此液为B液；

在4℃低温搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，全部滴完后，混合液搅拌1小时恢复至室温，即得到人工抗原混合液；

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；

将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的超纯水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：倍他米松-牛血清蛋白。

(3)倍他米松人工抗原的鉴定