[发明专利]褶皱臂尾轮虫微核制备技术

说明书

技术领域：

本发明涉及到轮虫微核的制备方法及其作为污染物毒性指标的应用，是一种应用细胞毒理学来进行环境污染物毒性检测的技术。

背景技术：

在化学物质中，有很多能引起染色体的异常，化学物质诱发染色体异常在细胞核水平表现为染色体丢失或断片形成而出现的微核，检测微核出现的几率可以作为衡量化学物质毒性的一种指标。目前，国内外对于从细胞毒理学角度研究生物对环境污染物的反应集中在以下几个方面；一是利用植物根尖细胞在有丝分裂过程中对重金属毒性的反应情况，如以蚕豆根尖、洋葱根尖、大蒜根尖等植物根系放入含有重金属镉离子的溶液中培养24小时，然后对细胞核进行染色，观察并统计产生微核的概率，以此来衡量重金属镉离子的毒性；二是利用动物细胞来做类似的实验，如利用小白鼠骨髓红细胞微核率来检测污染物的毒性。至今未见利用水体浮游生物的细胞核作为受试材料进行微核检测的报道。就水体污染物环境检测而言，充分利用水体的浮游生物，尤其是浮游动物来检测污染的程度是一个理想的指标，目前从细胞毒理学角度，尤其是利用陆生动植物中已经广泛应用的微核技术来作为检测指标还处于空白状态。

发明内容：

本发明是描述以水体浮游生物褶皱臂尾轮虫作为衡量水体污染物有害程度的一种微核技术，主要解决了轮虫微核的制备技术及其在水体环境监测上的应用，主要内容为先对轮虫进行毒性实验，再利用压片法从轮虫卵母细胞中制备微核，以统计微核率的大小作为衡量污染物毒性的指标，是一种新型水体环境检测技术。

附图说明：

图中线条指示的小核为微核，其周围两个大的核为卵母细胞核分裂后形成的两个细胞核。

具体实施方式：

本发明可以通过以下几个操作步骤实现：

一、轮虫采集及鉴别：从野外含有褶皱臂尾轮虫的水样中取水样，经虑网筛虑，浓缩含有轮虫的液体，用虹吸管吸取单个轮虫，放置于载玻片上，在解剖镜(4×10＝40倍镜)下鉴别轮虫的种类，挑选出褶皱臂尾轮虫。

二、轮虫扩大培养：从以上野外采集的水样中选取1000个左右的褶皱臂尾轮虫放入6孔细胞培养板中进行扩大培养。培养过程中选用淡水小球藻作为褶皱臂尾轮虫的饵料：投喂淡水小球藻时，小球藻与轮虫培养液的比例为1∶50。

三、重金属镉离子攻毒培养：以上轮虫集中培养2-3天后，把其平均分成8组分别放入12孔培养板中进行镉离子攻毒实验，方法如下：根据镉离子毒性剂量试验所测得的浓度范围，确定八个实验镉离子浓度即0.1mg/L，0.2mg/L，0.4mg/L，0.8mg/L，1.2mg/L，2.4mg/L，4.8mg/L和原培养液对照组实验。分别取上述浓度的镉离子处理液2毫升放在12孔培养板中，再在每个培养孔中放入大约200个活力较强的轮虫，然后每个培养孔中再加入0.5毫升的淡水小球藻，最后调节处理液的PH值使其达到8.0左右。把培养板放入25℃培养箱中，培养24-48小时。

四、微核镜检与制片观察：分别用吸管吸取一滴各浓度镉离子轮虫培养液滴在载玻片上，加入10％Giemsa染色液进行活体染色十五分钟，加上盖玻片后放在10×10倍显微镜下用解剖针轻轻挤压盖玻片，此时一边观察显微镜中轮虫形态的变化，一边反复挤压盖玻片，直至看见有液体从轮虫尾部流出为止；调整显微镜视野，观察盖玻片下所有轮虫的形态变化情况，直至利用解剖针把约80％左右的轮虫都从其尾部挤出液体为止。此时，用滤纸轻轻擦、吸干盖玻片周围的液体，调整显微镜，利用10×100倍的油镜进行观察。此时会在视野中发现大量的处于细胞核分裂状态的卵母细胞核出现，由于轮虫属于主要营孤雌生活的浮游生物，其繁殖力很强，所以每个轮虫都可以观察到15-30个左右的这样卵母细胞的存在。同时，在这些卵母细胞处于分裂期的细胞核周围，还会出现处于染色较深状态小细胞核(称之为微核)的存在。

五、微核统计与分析：对微核出现的数目和观察到的总卵母细胞数进行计数，每个镉离子浓度下约观察5000个细胞，统计微核率，微核率(％)＝微核数目/总观察细胞数。微核率统计结果见表1

表1轮虫微核率统计结果