[发明专利]表达具有免疫激活功能的发夹RNA的DNA疫苗载体及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因免疫领域。具体而言，本发明涉及用于提高DNA疫苗免疫原性的表达载体、具有增强的免疫原性的DNA疫苗及其制备方法。

背景技术

DNA疫苗又称基因疫苗、核酸疫苗或裸露的DNA。该类疫苗通过把抗原基因导入体内表达来诱导抗原特异性免疫反应，从而达到预防或治疗疾病的目的，因此也被称为基因免疫。DNA疫苗既可以诱导抗原特异的细胞免疫反应，又可以诱导抗原特异的体液免疫反应，具有安全、模拟天然抗原呈递过程、构建周期短、生产简单、成本低、载体本身无免疫原性、储存简单、无需冷链等诸多优点。作为一种新的疫苗形式，DNA疫苗的前景已经逐步得到肯定，不但在动物模型中表现出非常好的潜力(Haigwood N L，Immunol lett，1999，66(1-3)：183-188；Shiver JM，J PharmSci.1996，85(16)：1317-1324)，而且在临床试验中表现出很好的安全性，受试者对DNA疫苗的耐受性也非常好。目前DNA疫苗面临的主要问题是免疫原性较弱。多年来，疫苗学家一直在尝试不同的策略，期望能够提高DNA疫苗的免疫效果，并为此进行了许多努力和尝试。

DNA疫苗诱导免疫反应需要抗原呈递细胞获取足够的抗原并将其有效呈递，在这一过程中，协同刺激信号、炎症信号和细胞因子的产生是诱导特异性免疫反应所必需的。研究表明，来源于病毒的一些特征能够提供这类信号。很多病毒(尤其是RNA病毒)可以通过转录产生重叠的RNA或是在RNA复制过程中产生双链RNA中间体，而这些dsRNA分子可以作为一种病原相关分子特征(pathogen-associated molecularpatterns，PAMP)被免疫细胞内的Toll样受体(Toll-like Receptor，TLR)3所识别(Matsumoto M，Microbiol Immunol，2004，48(3)：147-154)，通过胞内信号传导通路，促进细胞因子的合成与释放，引发炎症反应，并能促进DC的成熟从而激活获得性免疫应答。另外，dsRNA分子还可以在胞内激活依赖于双链RNA的蛋白激酶PKR途径和2’-5’-寡聚腺苷酸合成酶/RNaseL途径(Barber G N，Cell Death Differ，2001，8(2)：113-126)，通过诱导细胞凋亡以交叉提呈(Cross-presentation)的方式激活特异性细胞免疫应答。因此如何将这种来源于病毒的特征应用于DNA疫苗载体中以激活更广泛的免疫调节机制成为提高DNA疫苗免疫原性的关键之一。

发明内容

在一个方面，本发明提供一种表达载体，该表达载体包含可操纵地连接于启动子的编码具有免疫激活功能的发夹RNA(hairpin RNA)的DNA序列。

在另一方面，本发明还提供一种重组质粒，该重组质粒包含一种表达载体和编码抗原的外源基因，其中所述载体包含可操纵地连接于启动子的编码具有免疫激活功能的发夹RNA的DNA序列。

在另一方面，本发明还提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含如上所述的本发明的表达载体或者本发明的重组质粒。

在另一方面，本发明提供一种具有增强的免疫原性的DNA疫苗，其包含如上所述的本发明的重组质粒。

在另一方面，本发明提供一种提高DNA疫苗免疫原性的方法，其包含将编码抗原的外源基因克隆到本发明的表达载体中以构建DNA疫苗。

此外，本发明还涉及本发明的表达载体在制备具有增强的免疫原性的DNA疫苗中的应用。

附图说明

图1为载体pDRVI3.1(A)、pDS40(B)结构示意图。Pcmv表示巨细胞病毒(CMV)启动子，BGHpA表示牛生长激素(BGH)polyA信号，Amp表示氨苄青霉素抗性基因，Ori表示复制起始区，MCS表示供外源基因插入的多克隆位点，DS40表示一段具有反向互补重复的片段，可以通过转录形成发夹RNA分子。

图2为pDRVI3.1-env，pDS40-env，pDRVI3.1-nef和pDS40-nef结构示意图。载体元件说明同图1。

图3为PCR扩增BGHpA片段及CMV启动子片段电泳图，1为PCR扩增产物BGH pA片段，2为PCR扩增产物CMV启动子片段，M为DNA分子量标准DL2000。

图4为PCR扩增BGHpA-CMV启动子联合片段电泳图，1为PCR扩增产物BGHpA-CMV启动子联合片段，M为DNA分子量标准DL2000。