[发明专利]人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗体

说明书

技术领域

本发明涉及预防和治疗用人源基因工程抗体的制备及应用，尤其是特异性针对高致病性禽流感病毒H5N1，具有中和禽流感病毒感染功能的我国禽流感恢复期病人来源的中和性抗禽流感病毒基因工程抗体。

背景技术

高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)是由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的禽类烈性传染病。高致病性禽流感病毒H5N1自1997年发生18人感染6人死亡疫情以来，一直受到国际社会的高度关注，特别是自2003年以来高致病禽流感病毒H5N1动物疫情在亚洲已成地方性流行，并且已经蔓延到欧洲和非洲。人感染病例以及发生人感染病例的国家和地区不断扩大，2003年底以来，截止2007年4月11日，全球新发人禽流感(H5N1)病例数已上升至291例，其中死亡172例。我国自2003年11月第一例禽流感病毒H5N1感染病例确诊以来一共有24例，其中15例死亡。高致病性禽流感病毒H5N1突破了种属屏障不仅对禽类带来巨大威胁，严重影响国家的经济发展，而且对人类健康也带来巨大的威胁，会不会由H5N1禽流感病毒导致一次流感大流行已引起全球的高度关注。流感病毒是一种球形或杆状、有包膜的单股负链RNA病毒，基因组分为8个节段。病毒囊膜表面的跨膜糖蛋白血凝素蛋白(HA)和神经氨酸酶蛋白(NA)是流感病毒的主要免疫原性抗原。HA识别靶细胞表面受体并与受体相结合，具有与宿主细胞膜融合活性，能够诱导机体产生保护性中和抗体。由于HA基因突变而引起的HA抗原变异往往会导致免疫失败和变异毒株流行，流感病毒频繁并且持续的发生抗原性变异，目前还没有有效的人用禽流感疫苗，也没有有效的治疗药物。作为一类新型特异性抗病毒感染的生物工程制剂，中和性抗体在抗感染治疗及紧急被动免疫预防方面一直扮演着重要的角色。因此，研制特异性针对H5N1禽流感病毒的中和性抗体尤其是针对不同H5N1分离株具有广谱中和效应的抗体以用于紧急预防和治疗是十分必要和可行的。

通过抗体分子基因水平的重组可获得多种多样的特异性鼠源及人源抗体，使对单克隆抗体的研究有了突破性进展并越来越显示出其重要意义及实际运用前景。80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术兴起和整个基因工程抗体技术研究领域的发展，使当今世界人源或基因工程抗体的开发研究取得很大进展并已由基础研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段。含有特异性抗体的人源或动物血清免疫球蛋白用以预防和治疗传染病已历史悠久。而人源基因工程抗体的发展，给这一领域的生物制品发展带来了新的希望和远大前景。单克隆抗体的体外抗病毒中和活性和体内保护肌体抵抗病毒攻击已获得许多实验证明，如鼠抗甲肝病毒、汉坦病毒、麻疹病毒、RSV病毒、CMV病毒等中和性单克隆抗体可以在体内100％保护动物免受病毒攻击，我们相信特异性中和抗体对高致病性禽流感病毒H5N1应当具有良好的预防和治疗效应。

人源抗病毒基因工程抗体，尤其是人源全抗体的研究成功，给各种病毒性传染病的特异性预防和治疗带来了新的希望，在抗病毒感染生物药领域逐渐形成了一类新的抗病毒药，即所谓的抗体药(Antibody Drug)。

发明内容

本发明的目的是通过基因工程手段和噬菌体表面表达技术结合运用，直接从人抗体基因库中筛选出抗高致病性禽流感病毒H5N1的基因工程单克隆抗体，获得其抗体基因，为将来可能的临床抗病毒预防和治疗提供可行性的特异性抗体药物。

本发明运用噬菌体表面呈现技术，从中国安徽某禽流感病人恢复期血中获得淋巴细胞，通过基因工程手段构建了人源抗H5N1禽流感病毒基因工程抗体文库，并筛选获得特异抗禽流感病毒基因工程抗体Fab段及其全抗体。

本发明的人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗体包括：

1、两株Fab抗体，分别命名为AVFluFab1和AVFluFab3。

这两株重组抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区(CDRs)特异性基因序列决定的，并在原核细胞中获得有效表达的特异性结合高致病性禽流感病毒H5N1的功能性抗体。它们特异性识别H5N1高致病性禽流感病毒颗粒抗原，且均针对禽流感病毒血凝素蛋白HA，与禽流感病毒H5N1具有明显的免疫荧光反应(IFA)和酶联免疫(ELISA)反应，具有抗禽流感病毒H5N1感染的中和活性功能。