[发明专利]“一管法”乙肝病毒核酸提取与扩增－荧光PCR定量技术

权利要求书

1.采用带有指示和变色功能的“微量核酸释放剂”，实现在同一管内直接进行核酸提取与荧光PCR扩增：微量血清与蓝色微量核酸释放剂在荧光PCR内混匀，蓝色微量核酸释放剂即变成无色，覆盖灭菌液体石蜡油经“85℃，30s→99℃，7min→5℃，30s”温处理后，直接加入荧光PCR工作液，即可进行荧光PCR扩增和分析结果。操作简捷、快速、无污染。

2.该技术可直接对血清、血浆和全血标本中的HBV DNA进行荧光PCR检测。

3.采用采用卫生部HBV标准质控血清，制备已知HBV DNA含量的4个梯度“原病毒血清标准品”，作为荧光PCR定量标准品，该标准品与血清(血浆或全血)标本同时进行核酸提取和荧光PCR扩增，实现从核酸提取到扩增的全程监控。

4.采用双正反向4条引物和正反向2条探针扩增技术，在传统正向引物、正向探针和反向引物模式基础上，增加了扩增核酸长度一致和TM值相同的临近反向引物、反向探针和正向引物的序列设计技术，该技术较单正向序列的探针扩增敏感性高10～50倍左右，扩增效率提高80％以上。

5.在无色的促荧光剂中加入终浓度为0.01％的石绿，使最终配制的PCR工作液呈浅蓝色，在PCR扩增的预变性过程退色，使PCR的操作轻松、准确，不但不影响荧光PCR的检测，而且具有稳定荧光信号和增强荧光PCR扩增效率的重要功能。

6.采用两段变性和复性温度梯度的设定方法，只在后段温度梯度的复性期采集荧光信号，该方法不但方便荧光曲线的分析，而且延长荧光PCR仪器的使用寿命。