[发明专利]快速定量检测活的双歧杆菌的方法

权利要求书

1.一种快速定量检测活的双歧杆菌的方法，其特征是：取样后，将样品 10倍稀释后，进行EMA处理，然后提取样品的DNA，进行分子信标-实时 PCR检测，根据标准曲线计算双歧杆菌的含量，所述的DNA提取过程是： EMA处理后的含双歧杆菌制品，加入18％的柠檬酸钠和1M NaOH， 10000rpm离心10min，收集菌体细胞，用无菌超纯水洗涤后，悬浮于无菌超 纯水中，取菌悬液，加入到浓度为2％的Tritox-100液中，100℃水浴处理10min 后，立即置于冰水中冷却，所得上清液直接用于分子信标-实时PCR扩增， 所述的含双歧杆菌制品的重量份数为1，所述的柠檬酸钠的重量份数为0.15， 所述的NaOH的重量份数为0.1，所述的无菌超纯水的重量份数为0.1，所述 的菌悬液的重量份数为0.01，所述的Tritox-100液的重量份数为0.1，所述的 EMA处理：EMA用量终浓度为1.5μg/mL，在650W卤素光源照射时间为 2min，所述的分子信标-实时PCR检测，其引物/探针浓度比为 0.8μM/0.4μM，荧光信号采集的退火温度为40℃，Mg²⁺浓度为2.5mM，循 环参数为：

所述的引物包括正向引物和反向引物，其中Bif-F为正向引物，长度为19bp， 序列为5′-TCTGGCTCAGGATGAACGC-3′，结合位点落在长双歧杆菌16S rDNA序列的20～38bp号位置；Bif-R为反向引物，长度为20bp，序列为 5′-CACCGTTACACCGGGAATTC-3′，结合位点落在长双歧杆菌16S rDNA 序列的655～674bp号位置，所述的分子信标探针5′端标记荧光基团FAM，6- 羟基荧光素，荧光发射峰值在518nm处，3′端标记淬灭基团DABCYL，4-4′- (恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸，荧光发射峰值在491nm处，两者之间构成能量 传递结构，分子信标序列为：

5′-FAM-CCAGGCATCCGGCATTACCACCCGTCCTGG-3′-DABCYL。

2.根据权利要求1所述的快速定量检测活的双歧杆菌的方法，其特征是： 所述的取样：无菌操作将充分混匀的含双歧杆菌制品的样品放入含有PBS缓 冲液的灭菌锥形瓶内做成1∶10的均匀稀释液，室温静置水合30min。

3.根据权利要求1所述的快速定量检测活的双歧杆菌的方法，其特征是： 所述的分子信标-实时PCR检测的方法的标准曲线是：以不同菌数的阳性模 板对数为横坐标，以PCR反应过程中出现荧光信号的初始循环数Ct为纵坐 标绘制双歧杆菌的标准曲线，浓度范围在2×10⁸～2×10⁴CFU/ml之间时，标 准曲线线性良好，相关系数R值大于0.97，所建立分子信标-实时PCR检测 标准曲线，Y＝-3.568X+42.322。