[发明专利]一种检测禽流感病毒抗原的装置及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及禽流感病毒抗原快速检测技术领域，特别是基于抗原抗体反应检测禽流感病毒抗原的电化学传感器及检测方法。

背景技术

禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)是源于禽类，能在极短的时间内造成大量禽畜死亡，并可致人类死亡的烈性传染病毒。近几年来，很多国家和地区相继爆发了高致病性禽流感，不但给相关产业造成巨大的经济损失，也严重威胁到人类健康与安全。

禽流感快速检测是疫病诊断，早期监控，防止疫情扩散，保证食品安全的最关键措施之一。

目前，禽流感病毒检测主要有以下方法：琼脂凝胶扩散试验(AGP)，免疫荧光技术(IFTr)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，酶免疫测定(EIA)技术，PCR及RT-PCR技术，核酸探针技术，RT-PCR-ELISA技术，荧光RT-PCR技术。

琼脂免疫扩散试验方法取材方便，操作简单，但检测时间长，敏感度低；免疫荧光技术和ELISA都需要特殊的仪器设备，检测过程复杂、费用高、检测时间长，并且易出现假阳性；PCR检测过程复杂、时间长，对操作人员专业技术要求较高、所使用的试剂对人体和环境均有较大的危害。

因此，建立一种灵敏、快速、特异性高且经济的检测禽流感病毒抗原的技术成为疫情诊断、早期监控的迫切需要。

在病毒检测领域中，免疫传感器因其快速、简便、灵敏受到越来越广泛的应用。免疫传感器是在传感界面固定抗原或抗体，通过测量由抗原、抗体特异性结合引起的物理、化学信号的变化，对样品中抗原或抗体进行定性或定量判定。

抗原-抗体结合前后可导致多种信号的改变，如重量、光学、热学、电化学等。电化学分析具有能现场检测，不受样品颜色、浊度的影响，样品可以不经处理，无需分离，所用仪器设备相对简单等优点，使得电化学免疫传感检测成为一种使用较为广泛的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏、快速、特异性高且经济的检测禽流感病毒抗原的装置及检测方法。

本发明的装置是基于抗原抗体反应检测禽流感病毒抗原的电化学检测装置，具有灵敏、快速、特异性高等优点，并且价格低，适用于基层或现场检测禽流感病毒。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

一种检测禽流感病毒抗原的装置，包括免疫传感器、电解池和数据采集与处理系统；免疫传感器包括印刷在绝缘基板上的工作电极、参比电极和辅助电极所构成的电极系统；电解池包括检测底液、搅拌器和温控器；数据采集与处理系统包括电化学工作站、计算机和软件系统；免疫传感器通过导线与电化学工作站相连，其特征在于免疫传感器的工作电极为碳电极，其上涂布有包埋酶标禽流感抗体的感应膜。

本发明装置的免疫传感器中，电极系统通过丝网印刷方法印在绝缘基板上，辅助电极为石墨电极，参比电极为Ag/AgCl电极，工作电极以碳电极为支持电极，其上修饰有包埋酶标禽流感抗体的感应膜。工作电极可以是多个，能同时检测多份样品。

酶标禽流感抗体可以是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氧酶、葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶或尿素水解酶标记的H5N1型禽流感抗体或其它禽流感抗体；

包埋酶标禽流感抗体的膜材料可以是壳聚糖、醋酸纤维素、PVB、Nafion、明胶或琼脂糖的一种或它们的混合物。

本发明还包括一种检测禽流感病毒抗原的方法，包括以下步骤：

1)待测样本滴于本发明装置的免疫传感器工作电极表面，20℃孵育10分钟；

2)免疫传感器置于电解池中，电解池的检测底液为含有0.4mmol/LH₂O₂的1mmol/L硫堇(Thionine，俗称劳氏紫)醋酸盐缓冲液，PH值为6.5；

3)设定适宜的扫描参数，对工作电极施加电压，检测辅助电极与工作电极间的电流值；

4)测定获得的电流信息输入数据采集与处理系统；

5)信息处理结果输出。

检测样本可以是死禽样本或活禽样本。死禽样本一般采集肠内容物或泄殖腔拭子、鼻拭子、咽喉拭子以及内脏组织(气管、肺、气囊、肠、脾脏、肾、脑、肝脏和心脏等)；活禽样本可采集气管拭子、泄殖腔拭子。由于采集棉拭子时幼禽容易受伤，所以还可取粪便。

对于泄殖腔拭子和粪便，用过滤器过滤除菌，上清液作为样本。内脏样本应无菌取样。