[发明专利]一种利用限制性内切酶处理DNA模板以增进DNA扩增效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及属于分子生物学技术领域，尤其是一种利用限制性内切酶处理DNA模板以增进DNA扩增效率的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)，又称体外酶促基因扩增，是一种在体外模拟DNA体内复制的基因扩增技术，该技术由K.Mullis于1985年发明，能在耐热DNA聚合酶的作用及特异性引物的引导下，在很短的时间里就能在一个试管内实现只有在生物体细胞分裂增殖时才出现的基因的大量复制，一般来说，在数小时内就可以将目的基因扩增至百万倍。

在过去的20多年的时间里，PCR技术在不断进步和发展中逐渐成熟，形成了一整套完整的技术体系。常规PCR技术操作简便，成功率很高，因而其在遗传学、微生物学、乃至整个生命科学领域的研究中都得到了广泛应用。但是PCR技术仍存在着一些不可避免的缺点，如，扩增产物的产量少甚至不能成功扩增等。虽然近年来一个又一个功能强大的引物设计软件被开发出来，但高特异性引物只是提高PCR反应效率的一个方面，对反应体系及反应条件进行优化组合则是解决这一问题的一个方面。根据多年来各国科学家的研究成果我们发现，通过向PCR反应体系中添加一定量的添加剂可以在不同程度上提高扩增产物的产量，这些添加剂包括DMSO、Betain、BSA、甘油、Tween-20、NP-40、NaOH、甲酰胺等。但这些添加剂都各有其局限性，在各种不同的情况下效果差异很大，给应用带来不便，尤其是对某些通常无法成功扩增的PCR反应无能为力。因此解决经添加各种添加剂仍不能成功扩增的PCR技术是PCR技术发展过程中一项十分重要的研究课题。

近年来，生物技术的发展日新月异，文献调研及专利检索发现，至今还没有对应用限制性内切酶处理DNA模板提高聚合酶链式反应(PCR)扩增效率的方法做相应的研究。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中的关键性问题而提供一种利用限制性内切酶处理DNA模板以增进DNA扩增效率的方法，本方法通过对待扩增DNA模板的酶切实现对难以扩增的DNA片段的有效扩增，从而提高目的DNA片段的扩增特别是高GC含量片段的扩增，且效果明显，使用简便，易于掌握。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种利用限制性内切酶处理DNA模板以增进DNA扩增效率的方法，其特征在于：增进DNA扩增效率的方法是：

(1).DNA模板的酶切分析

将待扩增区间的模板序列输入内切酶分析软件中，进行对本区间序列没有酶切位点的限制性内切酶分析，从而找出对该区间序列没有酶切位点的限制性内切酶名单；

(2).DNA模板的酶切

从上述限制性内切酶名单中选择限制性内切酶处理DNA模板，实施单酶切或组合酶切。

(3).PCR体系的配置；

(4).PCR条件的设定与运行；

(5).PCR产物检测：对扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检查扩增片段在凝胶中的位置，并与相应的分子量标准做对照。

而且，所述的限制性内切酶是指已知所有限制性内切酶且一般为市售产品。

而且，所述的PCR扩增包括常规PCR、长片段PCR、高GC含量的DNA片段的扩增。

本发明的优点和有益效果是：

1.本发明是生物技术发展的新成果，与已有方法相比，它较好地解决了PCR扩增效率不高，特别是高GC含量的DNA片段难以扩增的难题，使得扩增效果明显，有一定的应用范围。

2.本发明中应用的提高PCR扩增效率的方法——限制性内切酶酶切DNA模板，与已有的PCR扩增增效剂相比，它从根本上解决了某些PCR反应扩增效率低及难以扩增的问题。

附图说明

图1为基因组模板经BamHI、BglII、EcoRI、EcoRV酶切后扩增片段为754bp且GC含量为61％的DNA片段的电泳图；

图2为基因组模板分别经BamHI、XhoI单酶切后扩增片段为790bp且GC含量为78％的DNA片段的电泳图；

图3为基因组模板分别经XbaI、EcoRI、EcoRI+XhoI酶切后扩增片段为1541bp且GC含量为75％的DNA片段的电泳图。

具体实施方式

本发明通过以下实例进一步详述，但本实例所叙述的技术内容是说明性的，而不是限定性的，不应依此来局限本发明的保护范围。

本发明所涉及的提高PCR扩增效率的方法是通过对待扩增DNA模板进行限制性内切酶酶切来实现的，其具体操作方法如下：

1.DNA模板的酶切分析：