[发明专利]一种鉴定外周血DNA肝癌相关P53基因249位密码子突变的多重PCR的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及一种一次性扩增多个P53基因片段，从而鉴定外周血DNA肝癌相关P53基因249位密码子突变的多重PCR的试剂盒。

背景技术

原发性肝细胞癌(HCC)是一种严重威胁人类健康的恶性疾病，在我国发病率较高，病人占全球的40％～50％，年死亡率达20.4/10万人。随着分子生物学在医学领域的广泛应用，研究表明，肝癌的发生和进展与抑癌基因的突变及失活/癌基因的异常活化密切相关，是其产生的重要分子生物学基础。P53基因是当前受到广泛重视，已被深入研究了解的一个抑癌基因。P53基因的突变而导致的P53蛋白功能缺失已被证实与多种恶性肿瘤的发生及进展密切相关。在我国及多数发展中国家，肝细胞肝癌(肝癌)的发生与黄曲霉素B₁经食物摄入以及乙型肝炎病毒感染密切相关，且这类病人多伴有P53基因249位密码子突变。据统计，我国约40％以上的肝细胞肝癌伴有P53基因249位密码子突变。

传统的肝癌辅助诊断手段主要包括血清学检测和影像学检测两大类。血清学检测主要是利用血清中的甲胎蛋白水平测定对肝癌进行诊断，如中国发明专利申请200610112962.1号公开的一种检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱及含有该离心柱的试剂盒，该发明涉及了一种检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱。该离心柱由上部分离管和下部收集管组成。上部分离管装有偶联小扁豆凝集素(LCA)的亲合介质，上部分离管底部是一个滤布，下部收集管中装有缓冲溶液。小扁豆凝集素(LCA)能与甲胎蛋白异质体糖链相结合。另外，中国发明专利申请200510108154.3号公开的一种凝集素竞争法肝癌甲胎蛋白异质体APP-L3定量检测试剂盒，该试剂盒可作为肝癌早期诊断的指标，判断肝癌的发生，为肝癌的预防、诊断、治疗提供直接的支持。但由于在肝癌患者中仍有约56.6％可能出现甲胎蛋白检测阴性，且甲胎蛋白水平无法准确反映患者的疾病进展及预后，因此仍具有一定的应用局限性。

在对肝癌病人外周血DNA突变分析的研究中发现，外周血DNA的P53基因249位密码子突变检测可能作为肝癌的早期诊断指标，与其他检查指标相结合，可以进一步提高肝癌诊断的准确性。此外，前瞻性研究表明，伴有外周血DNA P53基因249位密码子突变的肝脏硬化病人，在两年内发生肝细胞肝癌的机率大大高于无外周血DNA P53基因249位密码子突变的肝硬化病人，因此外周血DNA的P53基因249位密码子突变可能作为发生肝细胞肝癌的诊断和预测指标。

P53基因位于人17号染色体短臂上，全长16-20Kb，共有11个外显子和10个内含子，其中第7外显子的249位密码子是最常见的肝癌相关P53基因突变位置，在我国占肝癌患者p53突变的80％以上。尽管其突变在理论上可能发生在三个碱基中的任意一个或者几个，但大量的研究证实，对于肝癌的P53突变，绝大多数的突变集中于少数几种单碱基突变(SNP)类型上。

传统的P53基因突变研究主要通过PCR-SSCP(聚合酶链反应--单链构相多态性)进行研究，并需通过酶切和测序进行验证，利用这些方法，目前已有大量研究对我国肝细胞肝癌常见的P53基因突变类型进行了详尽的分析和统计。尽管PCR-SSCP已在科研领域应用于P53基因突变的分析，但其步骤繁琐，费时费力，其较高的成本和昂贵的仪器设备也是许多中小型实验室所无法承担的。因此，有必要在上述现有技术的基础上，提供新的用于鉴定外周血DNA肝癌相关P53基因249位密码子突变的多重PCR的试剂盒。

发明内容

本发明的目的即是提供一种鉴定外周血DNA肝癌相关P53基因249位密码子突变的多重PCR的试剂盒。

本发明方法的基本思路是：选取肝癌常见的P53基因249位密码子突变，利用特异性引物扩增方法对P53基因249位密码子上的多个SNP位点进行复合扩增。

此处，所说的特异性引物PCR方法是：在SNP的突变位置上，设计两条特异性的正向PCR扩增引物，每一条引物仅能针对一种突变(野生型和突变型)进行扩增，同时，设计一条公共的反向PCR扩增引物。当利用这三条引物进行PCR反应时，不同特异性正向引物分别与反向引物共同作用后的PCR产物大小有差异(我们设计的试剂盒中的大小差异为2bp)，从而可以通过电泳检测时进行分型。