[发明专利]3株囊球粘细菌及筛选纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及3株囊球粘细菌(Angiococcus sp.)及其筛选纯化方法。

背景技术

粘细菌是最高等的原核生物类群，是以滑动方式运动的具有复杂的多细胞行为的革兰氏阴性细菌。粘细菌不仅在细胞分化、发育和生物进化研究中占有重要地位，而且粘细菌能产生丰富的次级代谢产物，产生抑菌活性的阳性菌率甚至高于著名的次级代谢物产生菌放线菌，至今为止，已经发现粘细菌产生了几百种结构不同的化合物，这些化合物中的许多是以前从未发现过的。因此，粘细菌是极具有研究开发价值的微生物类群。然而目前，粘细菌的分离纯化和培养耗时制约着粘细菌的研究，导致全世界只有很少数实验室研究粘细菌。所以，粘细菌及其次级代谢产物均显得非常珍贵。

发明内容

本发明分离得到了3株囊球粘细菌菌株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心保藏，保藏编号分别为：CGMCC1959，CGMCC1960，CGMCC1961。

筛选方法：

1.平板筛选：取兔粪适量，用抗真菌药浸泡6h，然后接种于含抗真菌药的安琪酵母水培养基平板，置30℃孵箱恒温保湿培养4天，及时挑取疑似粘细菌的菌落，转接于VY/4培养基(维生素酵母培养基/4：安琪酵母0.25％，CaCl₂·2H₂O 0.1％，维生素B₁₂0.5μg/mL，琼脂粉1.5％，pH 7.2)平板上，继续置30℃恒温保湿培养3-4天。

2.划线稀释纯化：从VY/4平板上挑取疑似菌落边缘的细菌，于VY/4培养基平板上划线，30℃恒温保湿培养3-4天。

3.低温冻融处理：将第2步所得单菌落接种于VY/4斜面培养基上，置-80℃冰箱冷冻48h，取出放至室温后立即转接于VY/4斜面培养基上，30℃恒温保湿培养3-4天。该步骤重复3次。

4.加热处理：将第3步所得疑似细菌的VY/4斜面置于58℃孵箱恒温保湿培养30min，然后放至室温，转接于另一VY/4培养基上，30℃孵箱恒温保湿培养3-4天。

5.进一步筛选：用酵母菌和大肠杆菌(活菌或死菌)在氯化钙水培养基(CaCl₂·2H₂O 0.1％，琼脂粉1.5％，pH 7.2)上交叉划线，将第4步所得疑似菌落转接于划线处，30℃恒温保湿培养3-4天。

依次经过上述5个筛选步骤，筛选得到纯菌株，将所得菌株分别在光学显微镜(革兰氏染色后)及扫描电子显微镜下观察细菌，其菌学特性为：3个菌株均为革兰氏阴性细菌，可在固体平板上滑动，在肉汤培养基中不生长，营养缺乏时易聚集形成子实体，可分解细菌和酵母菌，不能分解纤维素。CGMCC1959菌为杆状、两端略细，菌宽0.75-0.8μm，菌长3.7-5.4μm；菌落边缘有火焰状突出，分泌水溶性的金黄色物质；子实体复杂，1个粘杆上顶有1个或多个粘孢子，且子实体上有些粘孢子成曲折链状排列；粘孢子球形，直径1.3-1.6μm。CGMCC1960菌为船形，两端略细，菌宽0.6-0.7μm，菌长4-8μm；菌落边缘有火焰状突出，分泌水溶性的淡粉红色物质；子实体复杂，成丛存在，有分支，大小不等；粘孢子球形，直径0.9-1.1μm。CGMCC1961菌为杆状，两端略细，菌宽0.4-0.6μm，菌长3.7-5.4μm；菌落边缘有火焰状突出，有明显辐射状波纹，分泌水溶性的金黄色物质；子实体大小不等，1个粘杆上有2个至多个粘孢子，并且子实体上有些粘孢子成曲折链状排列；粘孢子球形，直径0.9-1.6μm。

本发明的上述方法分离得到了三3个菌株，根据《Bergey’s Manual ofDeterminative Bacteriology》第9版的描述，这3株菌均属于粘细菌的囊球粘细菌属。目前我国的粘细菌库中菌种很少，尚未见到具有上述菌学特性的粘细菌，因此本发明筛选得到的3个新菌株将极大地丰富我国的粘细菌库资源。

粘细菌是极具有研究开发价值的微生物类群，能产生丰富的次级代谢产物。实验结果表明，本发明的上述方法筛选得到的粘细菌菌株不仅能产生具有抗菌活性的次级代谢物，而且能产生具有纤溶活性的次级代谢产物，具有极大的研究和开发价值。

以下结合附图所示的试验结果，通过若干实例的具体实施方式，再对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于下述的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明