[发明专利]一种静息细胞转化甘油生产1,3－丙二醇的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，是关于一种微生物细胞转化甘油生产1，3-丙二醇的方法。

背景技术

1，3-丙二醇(1，3-propanediol，简称1，3-PD)是一种重要的化工原料，其本身是良好的溶剂、抗冻剂、保护剂及润滑剂，而且可以参与多种化学合成反应，作为有机合成原料和医药中间体而受到广泛的应用。其最有潜力的应用是与对苯二甲酸合成的聚酯(PTT)。近几年的研究表明，PTT较之以乙二醇与对苯二甲酸合成的聚酯(PET)具有更优良的特性，如尼龙样的弹性恢复，在全色范围内无需添加特殊化学品即能呈现良好的连续印染特性，抗紫外、臭氧和氮氧化合物的着色性，抗内应力，低水吸附，低静电以及良好的生物降解，可循环利用等。

目前，生产1，3-PD的方法主要包括环氧乙烷羰基化法、丙烯醛水解法和微生物转化法。其中环氧乙烷羰基化法、丙烯醛水解法属于化学合成法，其原料主要来自石油。微生物转化法则是以甘油、葡萄糖等可再生资源为原料，有着传统石油工业所无法比拟的优越性，符合21世纪可持续发展的需要。

目前为止，还没有发现有天然菌株能直接利用葡萄糖发酵生产1，3-丙二醇，只有少数细菌能直接利用甘油生产1，3-PD，这些菌包括克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏柠檬菌(Citrobacter freundii)以及乳杆菌属的短乳杆菌(Lactobacilli brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillibuchneri)，梭菌属的丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridia butyricum)以及巴氏固氮梭状芽孢杆菌(Clostridia pastruianu)。其中克雷伯氏肺炎杆菌、丁酸梭状芽孢杆菌、弗氏柠檬菌具有较高的1，3-PD转化率及生产强度，是当前研究的热点。

微生物利用甘油合成1，3-丙二醇是一个岐化代谢途径，包括一个氧化支路和一个还原支路。氧化途径主要有下面几步组成：(1)甘油在甘油脱氢酶(GDH)的作用下形成二羟基丙酮(DHA)；(2)二羟基丙酮在二羟基丙酮激酶的作用下，生成磷酸二羟基丙酮(DHAP)；(3)磷酸二羟基丙酮转变成3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛生成磷酸烯醇丙酮酸；(4)磷酸烯醇丙酮酸代谢生成丙酮酸，丙酮酸再进一步代谢成乙醇，乳酸，乙酸，丁酸，琥珀酸等终产物。还原途径主要有两步酶反应组成：(1)甘油脱水酶(GDHt)将甘油转化为中间产物3-羟基丙醛(3-HPA)；(2)3-羟基丙醛在1，3-PD氧化还原酶(PDOR)的作用下生成目的产物1，3-PD。

近几年由于石油价格的持续攀升，生物法制备1，3-丙二醇进一步受到国人的关注。但从国内目前的研究现状来看，利用微生物发酵甘油生产1，3-丙二醇还存在着一些问题：

(1)市场上精制甘油的价格较高，甘油转化生产1，3-PD与化学法比成本上不具有优势。而如果大量添加葡萄糖，蔗糖等廉价碳源，由于巴斯德效应，菌体将无法利用甘油也不能产1，3-PD。

(2)由于细胞的生长需要消耗底物甘油，使得产物对甘油的转化率难以提高。

(3)底物甘油、产物1，3-PD，副产物乳酸，乙酸，丁酸，以及3-羟基丙醛等有毒中间代谢物都会对细胞的生长产生不利影响，使得发酵液中菌体浓度难以提高，从而产物浓度也普遍不高。

(4)由于细菌培养液成分复杂导致产物分离纯化困难，这些问题的解决还需要新的转化方法的提出和改进。

发明内容

本发明的目的在于针对微生物发酵甘油生产1，3-丙二醇存在的问题，提供一种新的微生物细胞转化甘油生产1，3-丙二醇的方法。

本发明提供一种微生物细胞转化甘油生产1，3-丙二醇的方法，所述微生物细胞为静息细胞。

其中，所述微生物选自：克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)，弗氏柠檬菌(Citrobacter freundii)，丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridiabutyricum)，巴氏固氮梭状芽孢杆菌(Clostridia pastruianu)，以及它们的基因工程菌。

本发明所述的静息细胞为非固定化细胞或固定化细胞，所述固定化细胞的制备过程为：将静息细胞加入熔化的琼脂溶液中混合均匀，凝固后即制得固定化细胞。

本发明所述微生物细胞转化甘油生产1，3-丙二醇的制备过程为：

在含甘油5-120g/L的转化液里，加入静息细胞5-100g/L，20-42℃转化4-60h。

根据本发明，所述转化甘油的过程中，通入空气或氮气。

本发明的静息细胞通过以下方法制备：