[发明专利]制备α1－抗胰蛋白酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是一种药用α₁-抗胰蛋白酶制剂的制备方法。

背景技术

α₁-抗胰蛋白酶(α₁-antitrypsin，α₁-AT或AAT)是由肝细胞合成的一种血浆蛋白，分子量为55,000道尔吨，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族。α₁-AT是体内最重要的蛋白酶抑制物，它不仅作用于胰蛋白酶，同时也作用于糜蛋白酶、尿激酶、肾素、胶原酶、弹性蛋白酶、纤溶酶和凝血酶等。

正常情况下α₁-AT由肝大量的生成并分泌，在血浆中以较高浓度(典型浓度为1.3mg/ml)循环；另外生理有效的并且足够浓度的α₁-AT发现于健康人的一些器官，尤其是肺液(上皮层液)中。α₁-AT的活性下降，可源于数量上的缺乏，如先天性的α₁-AT缺乏症；也可由于功能性的不足，如吸烟和细菌感染时抗蛋白酶的活性中心失活。研究结果表明，对于α₁-AT缺乏患者，服用外源型人α₁-AT可以抑制弹性蛋白酶，从而改善存活率，降低肺部功能损失率，因此用外源性α₁-AT替代或补充这些炎症性肺病是可取的(Crystal et al.，AM.J.Respir.Crit.Care Med.158：49～59(1998)；Mathadeva R and Lomas D.，Thorax53：501～505(1998))。

因为α₁-AT在临床应用中的治疗作用，α₁-AT产品被广泛进行研究。Glaser等(Biochemistry，5：333～348(1975))揭示了一种从Cohn组分沉淀分离α₁-AT的方法，该沉淀用pH8.5的磷酸缓冲液溶解并搅拌来激活α₁-AT(在pH5.2的Cohn组分中α₁-AT大部分失活)，透析和离心，上清液过两次离子交换柱，首先在pH6.0～7.6和8.6条件层析，接着在pH7.6和8.0条件下进一步层析，产生的α₁-AT收率在30％左右。

Coan等(Vax Sang48：333～342(1985)；Amer J Med84(sup6A)：32～36(1988)；Eur Respie J3(sup9)：16s-20s(1990))发明一种工艺，从Cohn组分IV-1中获得45％的α₁-AT，其纯度大约在60％。该工艺是用pH6.5～8.5的缓冲液溶解Cohn组分IV-1沉淀，加入PEG，并将pH降低到4.6～5.7，从而沉淀杂蛋白；然后离心，上清经离子交换层析分离。

Arrighi等(欧洲专利EP0717049)提出了一种提取α₁-AT工艺。Cohn组分IV-1用pH8.2的缓冲液溶解并搅拌1小时，温度控制在42℃；后用硫酸铵沉淀杂蛋白，离心，上清在pH7.2条件下经疏水层析分离。

Glaser等(Anal.Biochem124：364～371(1982)；欧洲专利EP0067293)发明了从Cohn组分IV-1沉淀中分离α₁-AT方法。该方法是用pH8.5的缓冲液溶解Cohn’s低温乙醇工艺的沉淀物组分IV-1，采用二硫苏糖醇处理，并综合硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素层析，所提取获得的α₁-AT纯度只有70％左右。

Lebing等(美国专利WO02/48176A1)利用沉淀方法去除部分杂蛋白，离心所得到的上清液经离子交换介质层析收集α₁-AT，再将收集到的α₁-AT溶液用阳离子介质分离，所得的溶液经冻干加热法、去污剂及纳米膜过滤等方法去除脂包膜和非脂包膜病毒。