[发明专利]一种防治脱发和促进生发的siRNA及其制备方法和应用

权利要求书

1、一种防治脱发和促进生发的siRNA，其特征在于它由下述方法获得：将基因片断SR和AR连接而成的人工基因构建到表达有颈环结构SR-AR双链RNA的表达载体pET-SAAK上；转化大肠杆菌后进行发酵，表达生产dsRNA；离心收集大肠杆菌菌体，以均质机破碎法破菌，得到RNA抽提物，该抽提物用CF-11树脂进行吸附，洗去单链RNA和DNA分子，洗脱收集dsRNA部分，洗脱液通过酒精沉淀回收得到dsRNA；再以RNaseIII将长链的dsRNA切成18-25bp的siRNAs，除去RNase III，获得防治脱发和促进生发的siRNAs；其中，SR为睾丸激素还原酶基因片段，AR为雄激素受体基因片段。

2、一种在大肠杆菌中表达dsRNA的表达载体pET-SRAR，其特征在于载体以pET-226为出发质粒，在Bam HI和Eco RI酶切位点之间插入一段非细菌来源的外源片段作为loop，得到pET-loop质粒，基本构成元件包括正向序列A片段、反向重复序列B片段，其中A、B片段由睾丸激素还原酶基因片段及雄激素受体基因片段经重组而成，两个片段的基因序列为SEQ.ID.NO1。

3、一种siRNA脂质体，其特征在于由脂质对权利要求1所述的siRNAs进行脂质体包埋后获得。

4、一种如权利要求1所述的siRNAs的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

构建权利要求2所述的表达载体pET-SRAR，将基因片段SR及基因片段AR连接而成的人工基因构建到表达有颈环结构SR-AR双链RNA的表达载体pET-SAAK上；转化大肠杆菌后进行发酵，表达生产dsRNA；离心收集大肠杆菌菌体，以均质机破碎法破菌，得到RNA抽提物，该抽提物用CF-11树脂进行吸附，洗去单链RNA和DNA分子，洗脱收集dsRNA部分，洗脱液通过酒精沉淀回收得到dsRNA；再以RNase III将长链的dsRNA切成18-25bp的siRNAs(小分子干扰RNA)，除去RNase III，获得防治脱发和促进生发的siRNAs。

5、一种如权利要求3所述的siRNAs脂质体的制备方法，其特征在于具体步骤如下：按照注射级大豆卵磷脂∶胆固醇∶维生素E＝100∶8-12∶0.8-1.2的配方，称取以上脂质，溶解于氯仿中，在35-40℃温度下经旋转减压薄膜浓缩法，蒸发形成脂膜，以氮气除去残存氯仿，35-40℃抽气条件下，加入5-8mm直径的玻璃珠数粒，以1克脂膜加入23-27毫升pH值为7.0-7.4的含0.5％吐温80、10mg维生素C和待包埋的siRNAs的磷酸盐缓冲液对脂膜进行旋转水化15-20分钟至乳白色；冰水浴条件下对水化液进行超声处理2-3次，每次3-5分钟；再用分子筛层析纯化得到包埋siRNAs的脂质体。