[发明专利]靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA重组腺病毒及其用途

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及重组腺病毒，具体涉及靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA重组腺病毒及其在抑制人肺腺癌细胞体内生长中的作用。

背景技术

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)通过与配体结合形成复合物，引起一系列的生物效应，促进上皮再生、刺激体内多种细胞的分裂。EGFR基因的扩增及产物的过度表达与人体肿瘤的发生密切相关，人类多种肿瘤存在EGFR的过度表达。EGFR过表达与肺癌的恶性程度、转移、放化疗敏感性及预后密切相关，阻滞EGFR通路能有效地抑制肿瘤生长，说明EGFR是一个非常有前途的肺癌靶向治疗的靶点，以此靶点开发有效的药物可望使目前效果不甚理想的肺癌治疗有所突破。

目前以EGFR为靶点的肿瘤生物治疗手段存在有效率低、在延长患者生存期方面无优越性、价格昂贵、转染效率低、表达不稳定等问题，使得调控EGFR的肿瘤治疗研究尚未有突破性进展。

RNA干扰是由双链RNA引发的一种高效基因表达抑制途径，是转录后基因沉默的重要机制。近年来这一技术发展迅速，目前已经在基因组功能研究和疾病的基因治疗研究中取得了巨大进展。RNA干扰技术阻断基因表达具有高效率和高特异的特点，且RNA干扰具有级联放大效应，甚至其效应可传递至子代细胞，是适合肿瘤基因治疗的新手段。目前RNA干扰应用于临床治疗的主要难题就是如何增加小干扰RNA稳定性并提高导入效率，以提高RNA干扰的效率并延长RNA干扰效应时间。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA重组腺病毒。

本发明的进一步目的是提供上述重组腺病毒在抑制人肺腺癌细胞体内生长中的用途。

本发明针对肺癌治疗和基因调节技术的难点，实现动物体内核酸导入，产生RNA干扰效应，下调EGFR表达，抑制肿瘤生长。

本发明使用pSilencer adeno 1.0-CMV腺病毒载体系统(美国Ambion公司)，构建shuttle vector-穿梭载体(图1)，其中，修饰的CMV启动子驱动小发夹RNA表达，由修饰的SV40polyA signal作为终止子，和backbone vector-骨架载体在包装细胞293细胞中发生同源重组，得到预期的复制缺陷型重组腺病毒。

本发明的重组腺病毒通过下述方法制备：

根据EGFR基因在GenBank中的序列(NM_005228)设计对应的小干扰RNA。设计原则是：从启动子下游75碱基处寻找到第一个AA二聚体；记录AA下游19个碱基序列为目的序列；计算目的序列中嘌呤和嘧啶的含量百分比(G/C)。G/C比值接近50％为较理想，标准是大于30％小于70％；如果选择的序列中G/C含量不能达到要求，继续搜寻下一个AA二聚体，直到获得满意结果；在GenBank表达序列标签数据库中用BLAST检索，确认所设计小干扰RNA序列的唯一性。设计的针对EGFR基因的小干扰RNA序列，正义链：5’-GGAGCUGCCCAUGAGAAAU-3’；反义链：5’-AUUUCUCAUGGGCAGCUCC-3’；化学合成小干扰RNA初步验证了其抑制EGFR基因表达的效应；

以此序列为基础，设计靶向EGFR的小干扰RNA DNA表达模板：

5’-TCGAGGGAGCTGCCCATGAGAAATTTCAAGAGAATTTCTCATGGGCAGCTCCTT A-3’

3’-CCCTCGACGGGTACTCTTTAAAGTTCTCTTAAAGAGTACCCGTCGAGGAA TGATC-5’序列进行酶切分析保证其中无Pac I，EcoR I，HindIII酶切位点；

使用pSilencer adeno 1.0-CMV腺病毒载体系统(美国Ambion公司)，以穿梭载体的多克隆位点中Xho I和Spe I为插入位点，将上述靶向EGFR的小干扰RNA DNA表达模板与穿梭载体连接，即构建了靶向EGFR基因的小干扰RNA穿梭载体，其中，修饰的CMV启动子驱动小干扰RNA表达，由修饰的SV40polyA signal作为终止子(图1)；

将上述构建的靶向EGFR基因的小干扰RNA穿梭载体和骨架载体在293细胞中同源重组，得到靶向EGFR的小干扰RNA重组腺病毒Adv-shEGFR。

将所得的重组腺病毒扩增、纯化、鉴定后，测定病毒滴度和感染效率，分析重组腺病毒抑制EGFR表达的效率。以插入无关序列表达模板的重组腺病毒Adv-shNEG作为研究对照。