[发明专利]鱼类线粒体DNA控制区扩增引物及其设计方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类鉴别技术领域，具体的说，涉及一种鱼类线粒体DNA控制区扩增引物及其设计方法和应用。

背景技术

动物线粒体DNA(mtDNA)由于具有拷贝数高、分子量小而稳定、无组织特异性、一级结构进化速度快等特点，在遗传上具有自主性，是严格的母系遗传，已成为保护生物学和进化生物学研究一个强有力的工具。线粒体基因组由37个编码基因及一段主要的非编码区(控制区)组成，不同序列区域的进化速率不同。而位于编码脯氨酸(Pro)和苯丙氨酸(Phe)tRNA基因之间的区域是mtDNA上主要的非编码区，又称为控制区(control region)或D-loop区。一般认为，D-loop区是线粒体基因组上进化最快的部分，它的变异速率约为mtDNA完整分子或mtDNA分子上其它区域的5～10倍，适于亲缘关系较近的群体间的比较研究，是进行鱼类群体遗传结构揭示、濒危物种的遗传多样性程度鉴定等研究方面的重要遗传标记。

利用mtDNA D-loop碱基突变和重复序列区变异分析群体遗传纯度和鉴定不同群体、个体的亲缘关系已在许多动物研究中广泛开展。D-loop在mtDNA复制和转录中的特殊作用，使得D-loop结构和功能的研究成为mtDNA研究的热点。当前通过序列差异来鉴别外型上相似的鱼类是一种十分便利和准确的方法，其中线粒体控制区序列差异的研究，已应用于种类鉴别和分子系统进化分析等方面。

发明内容

本发明的目的在于提供一对可高效扩增鱼类线粒体DNA D-loop控制区的扩增引物。

本发明的另一个目的是提供上述引物的设计方法。

本发明的进一步目的是提供上述引物在鱼类种类鉴定、地理种群鉴别或种质资源评估中的应用。

本发明设计的鱼类线粒体DNA控制区扩增引物是一对简并引物，其上游引物MitD1-F有21个碱基：CAC CCYTRR CTC CCAAAGCYA，下游引物MitD1-R有23个碱基：GGT GCG GRK ACT TGC ATGTRT AA。

本发明的鱼类线粒体DNA控制区扩增引物设计的步骤为：登陆GenBank搜索目前已测定线粒体DNA全序列的161种鱼类的线粒体控制区(D-loop)基因，去掉不完全和部分的序列，主要选取淡水鱼类的线粒体的D-loop基因序列进行同源性比较，寻找保守序列，利用简并性原则，获得一对通用的简并引物：其上游引物MitD1-F有21个碱基：CAC CCY TRR CTC CCA AAG CYA，下游引物MitD1-R有23个碱基：GGT GCG GRK ACT TGC ATG TRT AA。扩增片断大小在1kb左右。

可扩增多数鱼类线粒体DNA D-loop控制区基因的简并引物PCR反应体系和反应条件如下：

PCR反应体系为28μL，内含dNTP(1mM)、Ex Taq Buffer(10×)、10μM的引物MitD1-F和引物MitD1-R、Ex-Taq酶、含50～150ng的DNA模板溶液、ddH₂O。

Ex Taq Buffer(10×)        2.5μL

dNTPs                      2μL

MitD1-F                    2μL

MitD1-R                    1.5μL

Template                   1μL

ddH₂O                      19μL

Ex-Taq酶                   0.1μL

扩增条件为：92℃预变性5min，然后98℃变性10s，54℃退火20s，72℃延伸60s，共33个循环，最后在72℃充分延伸10min。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度及亮度。

本发明所述的鱼类线粒体DNA控制区扩增引物能扩增鱼类线粒体DNA D-loop控制区基因，均能获得单一的目的DNA片段，产物大小为1kb左右，并对所有PCR扩增产物进行直接测序。其步骤为：PCR扩增产物经初步定量后，浓度达100ng/μl的样品委托公司进行双向直接测序，测序引物为扩增引物MitD1-F(10μM)和MitD1-R(10μM)，序列分析仪为ABI 3730型全自动DNA测序仪。