[发明专利]从动物血中分离三种酶(制剂)的联产工艺

说明书

技术领域

本发明涉及分离酶的生产工艺，尤其是涉及一种从动物血中分离三种酶的联产工艺，属于生物化学制备领域。

背景技术

SOD、CAT、THR都是酶，它们主要功能有：SOD是一种药用酶，它是一种活性氧自由基的转移清除剂，在临床上主要用于肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、放射治疗后遗症及有关炎症的防止上，此外在食品、日化等领域也已广泛得到应用；THR是机体凝血系统中的天然成分，在临床上已开发成为一种新型局部止血药。而CAT在现代纺织业、乳业、造纸业及食品医药行业上已有应用，用于清除过量的(残余的)过氧化氢。

目前许多专利文献对上述三酶的制备方法均有大量的报道，但大都是单产。联产工艺报道较少，主要有：王永权等，生物工程学报[2005，21(3)：466~472]报道从红细胞中采用推层析法分离SOD、CAT和血红蛋白新工艺(二酶联产)；辛春艳等，[河北省科学院学报，2002，19(4)：250~253]从猪血中获得凝血酶、SOD和水鲜蛋白(二酶联产)；凌敏等，[广西医科大学学报，2005，22(3)：363~364]研究了从猪血中分离SOD、血红素和蛋白胨工艺；美国专利，[1982，US patent，4341867。Jack T.Johansen，Rungsted K’yst，Denmark，Process for recouering eng’ymes from Blood]报道从血液中同时提取SOD、CAT及碳酸酐酶的工艺(三酶联产)。

发明内容

本发明的目的是，根据上述的技术缺陷，提出了一种简化工艺、避免用有机溶剂等化学方法、提高工艺效率和产品质量的从动物血中分离三种酶的联产工艺。

本发明的技术方案是这样实现的：一种从动物血中分离三种酶的联产工艺，其工艺步骤为：

1、新鲜动物血加柠檬酸三钠抗凝剂，充分搅拌，通过离心机离心(3000rpm，30min)得血浆和血球。血浆提取凝血酶，血球提取SOD和CAT。

2、凝血酶提取

1)血浆加水稀释，用1％乙酸调节pH5.3，离心5-10min，离心弃去离心液，收集沉淀，的凝血酶原。

2)分离、沉淀、洗涤：取凝血酶原溶于NaCl溶液中(0.9％)加入CaCl₂(1.5％)，搅拌10min，冷室放量1n，离心分离，沉淀为血纤维蛋白，溶液加等量丙酮，静置过应，沉淀用乙醚洗涤，真空干燥的粗制凝血酶。

3)除杂质、沉淀、干燥，去粗酶溶于0.9％CaCl₂溶液中，0℃放置6h过滤，然后用1％乙酸条pH至5.5，离心弃沉淀。清夜加工倍量冷丙酮，沉淀分别用乙醇、乙醚洗涤，真空干燥即得精致凝血酶。

3、SOD和CAT混合液制备

将血球加等体积0.9％NaCl溶液洗二次，获得了干净的红细胞，然后加等体积的去离子水溶血30min，溶血液加二价金属氯化物用于去除杂蛋白。65℃加热10min，离心的含SOD和CAT的粗酶液。然后用截留分子量10万的过滤膜将二酶分开，过滤流击液含分子量较小的SOD等蛋白，浓缩液含分子量较大的CAT等蛋白。过滤液备用分别用作提取SOD和CAT等酶的原料。

4、SOD提取

上述过滤清液加入0.3mol/L的CuCl₂和ZnCl₂溶液，充分混匀，然后用截留分子量10000的过滤膜浓缩至原体积的1/10~1/2的过滤浓缩液。热度性(65℃，10min)去杂蛋白，离心的清液，接着DEAE-SephadexA-50柱，即可得比活在5000u/(mg。蛋白)的高纯度SOD。SOD在液体中易失活，通常将其制成冻干粉。

5、CAT的提取

上述浓缩液，加等量0.3mol/L的溶液，充分搅拌，然后用截留10万分子量的过滤膜浓缩至原体积的1/2，重复二次。然后条pH至4.5，先进行等电点沉淀，然后加蛋白沉淀剂聚丙烯酸钠(PA)，离心弃沉淀(3000rpm，30min)，这样就可以得到CAT的精制溶液。在常温下，CAT易失活，通常在精制液中加0.5％Na₂S₂O₃和3％的甘油保护剂，这样CAT的保存活力至少在半年以上。

具体实施方式

一种从动物血中分离三种酶的联产工艺，其工艺步骤为：

1、将20克柠檬酸三钠加入到1000克的牛血中，3000rpm离心30min，得到600克血浆和400克血球。