[发明专利]配体检测方法

说明书

技术领域

本发明是申请人于2003年1月28日提交的中国专利申请03114490.X、发明名称为“新型配体检测方法”的分案申请。

本发明涉及一种新型利用核酸配基的配体检测方法，尤其是涉及一种经信号分子修饰的配体特异寡核苷酸配基建立的检测配体的方法。

背景技术

抗原检测是通过抗体对抗原分子上特异决定簇的有效识别来实现的。抗原检测，特别是蛋白质的高灵敏度检测对医学研究、后基因组计划的完成及临床检验具有非常重要的作用。目前，特异识别抗原的常用技术是ELISA(酶联免疫吸附试验)，它是通过特异抗体识别抗原决定簇，并通过连接于抗体上的酶、荧光物质、放射性同位素来完成抗原信息的识别、放大，从而实现检测目的。近年来，虽然ELISA检测技术有了很大的发展，但是，当检测样品量有限、或抗原浓度极低、或抗体效价不高时，就无法用传统的ELISA技术进行检测。

随着基因技术应用的快速发展，在抗原抗体检测方面已有较多的基因检测技术。

Gold等在1995年(Gold L，et al.Annu Rev Biochem，64：763--797)应用SELEX筛选出的系统性红斑狼疮特异抗体的RNA和ssDNA配基，不仅对系统性红斑狼疮进行诊断，而且进行病情监测和疗效检验。Gold等又在1999年(Gold L，et al.Diagn Dec；4(4)：381-8)在配基微阵分子诊断应用研究中，对配基微阵分辨率进行研究。均显出核酸配基检测有巨大的应用前景。但是目前的配基检测都是采用直接对配基PCR扩增放大检测的方法。这种方法操作复杂，需要将配体和配基分离，且灵敏度低(由于配体和配基分离后，配基纯度及残留配体和配基的再结合阻断DNA复制)和准确性差。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种利用经修饰的配体特异寡核苷酸配基建立的配体检测方法，该方法操作简单，灵敏度高，特异性强，核酸修饰序列信息量大，可进行微量多样检测等。

本发明的目的可通过如下措施来实现：

本发明的检测方法是利用特异寡核苷酸配基与配体特异表位的有效识别、结合；特异寡核苷酸配基是通过SELEX技术，即：从含有一定长度(40-60个NcDNA)的随机序列，5’和3’两端为固定序列，这些固定序列长度一般为15-30个核苷酸不等的(10¹⁵个)寡核苷酸组成的文库，其中SELEX所用的引物与文库模板两端固定序列相互补，对配体经过十几轮SELEX过程筛选得到的一段20-40个特定碱基的寡核苷酸家族。特异寡核苷酸配基再通过标记核酸序列的修饰、PCR信号放大、识别和分析，来实现对配体检测。

本发明提供一种配体检测方法，包括下述步骤：

(1)选择待测配体特异寡核苷酸配基；

(2)对步骤(1)中的特异寡核苷酸配基用用信号分子进行修饰；

(3)将修饰后的特异寡核苷酸配基与待测配体直接接合形成配体-配基复合物；

(4)然后将配体-配基复合物上的修饰核酸进行PCR扩增；

(5)用与修饰核酸互补的、带有标记物的探针与扩增后的修饰核酸序列杂交得到核酸杂交链；

(6)然后检测核酸杂交链上的标记物，即可检测到待测配体。

根据上述方法，还包括下述步骤：

a、将用信号分子修饰的特异寡核苷酸配基与待测配体接合，形成配体-配基复合物；

b、检测复合物上的信号分子，即可检测到待测的配体。

所述的信号分子选自化学发光物质、酶、荧光和同位素中的一种。

所述的配体是指核酸、蛋白质、多肽、有机染料、ATP、金属离子类的任何分子。

所述的配体特异寡核苷酸配基是指能与配体直接结合的单链DNA。

所述的配体特异寡核苷酸配基是指能与配体直接结合的单链RNA。

根据上述方法，可制成检测试剂和相应的检测试剂盒。。

本发明相比现有技术具有如下优点：

1、本发明的配体特异寡核苷酸配基经过信号分子修饰后，可建立一种配体检测技术及多配体检测技术体系。通过对筛选出的配体特异寡核苷酸配基经过人为序列(标记序列)修饰后；再通过配体和配基的特异结合，制成对应与不同配体的标记序列；经过标记序列的PCR信号放大、寡核苷酸微阵芯片的检测，可完成对单一和多种配体的检测。