[发明专利]用于定性分析分子相互作用的方法

说明书

技术领域

本发明是关于可用于定性分析高亲和力分子反应的方法及组合物。

背景技术

许多生产治疗性单克隆抗体的生物技术公司的目标是研发以高亲和力与生物靶标结合的抗体。大多数治疗性抗体具有毫微摩尔范围内的亲和常数且许多研究致力于提高亲和力以接近皮摩尔范围。能够进行结合反应动力学或实时测量的仪器(例如，可自福特生物(FortéBio)公司购得的标准具基于纤维的系统及可自巴考(Biacore)购得的基于表面等离子共振的仪器)在监测双分子相互作用方面较为有利，因为其可用于确定结合的缔合及解离阶段二者的速率常数，且因此提供优于基于平衡的结合测量的优点。因此，基于动力学的定性分析代表测定生物反应(例如抗体与受体结合反应)亲和力的优选方法。然而，高亲和力反应(例如那些涉及高亲和力抗体的反应)给这些方法造成挑战。结合解离阶段时间期限的跨度可能自数小时(对于毫微摩尔解离常数，KD)至数天(对于皮摩尔解离常数，KD)。对于解离速率测量来说，一般通过固定一个组件且允许另一个结合所述经固定组件在传感表面上形成结合复合物。为便于论述，我们集中于抗体结合反应，但所阐述及主张的方法原理及实践适合于任何结合反应，包括那些涉及其他生物分子的结合反应。对于抗体结合亲和力测量来说，一般将抗原固定在传感表面上。随后将所述表面暴露于含有所关注抗体的溶液中，并进行结合。一旦发生结合，即将所述传感表面暴露于缓冲溶液(即，最初不含有游离抗体的溶液)中并实时连续监测解离速率。对于高亲和力抗体需要连续监测解离数小时至数天，此占用仪器，因此限制了样品通量。

延长的解离速率测量对仪器寄予了最小化基线漂移的额外性能要求，所述基线漂移可能干扰速率测量并导致错误结果。在诸如那些由福特生物及巴考出售的固相仪器中，固相提供潜在影响表观解离速率的扩散障蔽层。当抗体从抗原解离时，所述固相限制抗体扩散，使其仍接近于抗原，因此使抗体与表面上的抗原再结合的可能性增加。抗体再结合在传感表面上可能会导致异常缓慢的表观解离速率常数。因此，业内需要用于定性分析结合反应的改良方法。本发明提供针对现有技术的这些及其他缺点的解决办法。

发明内容

本文揭示用于定性分析结合反应的方法及组合物。所述方法尤其适用于特征在于解离常数在毫微摩尔至皮摩尔范围内的反应。一方面，本发明方法包含在溶液中提供受体及第一形式配体，等待一段时间以允许所述受体及配体基本上达到结合平衡，随后向所述溶液中添加第二形式配体，并在固相结合分析中测定由所述第一形式配体与所述固相结合所产生的信号。另一方面，所述第一形式配体与固相特异性结合且所述第二形式配体不与固相特异性结合。再一方面，在添加第二形式配体之前，基本上所有第一形式配体都与受体结合。又一方面，实施多次固相结合分析，其中在添加第二形式配体后的多个时间测定信号。另一方面，所述时间中至少两个时间彼此相差至少5小时、或至少10小时、或至少20小时、或至少100小时。另一方面，所述测定信号中至少两个信号彼此有所不同。又一方面，所述方法包括计算解离速率常数。再一方面，所述方法包括自测定信号计算结合第一形式配体与游离第一形式配体的比值或所述比值的倒数。又一方面，在相同容器中实施多次固相结合分析。再一方面，所述固相结合分析对样品没有破坏性。另一方面，所述固相结合分析是基于纤维的分析。又一方面，所述基于纤维的分析包含产生干涉测量信号。另一方面，所述固相结合分析是基于表面等离子共振的分析。

例示性实施例包括使用标准具-基于纤维的或基于表面等离子共振的仪器所实施的分析。

在本发明变体中，所述反应涉及抗体及抗原。在另一变体中，两种形式配体在包括可特异性地与固相结合的标记方面有所不同。在优选实施例中，所述标记是生物素，并且所述固相包括抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。

附图说明

参阅以下阐述及附图可更好地理解本发明的这些及其他特点、方面及优点，其中：

图1是绘示本发明的步骤及用福特生物公司制造的Octet^TM生物传感器实施本发明所获得的结果的图示。

图2绘示使用Octet^TM生物传感器用其中抗体为抗-FITC、第一形式配体为FITC-葡聚糖-生物素且第二形式配体为FITC-葡聚糖的模型系统所获得的介于0时间至9小时范围内的5个时间点的标准化数据(所述数据拟合获得解离速率常数)及使用本发明方法及现有技术分析所获得的解离速率的比较。

图3绘示使用与图2中相同的仪器及模型系统在介于10分钟至9小时范围内的4个不同时间点的原始数据。