[发明专利]人平滑肌细胞的获得方法及其用途

说明书

本发明涉及从人肌活检样品或从体外分化成为骨骼肌细胞(hSkMC)的人肌活检样品中体外获得主要包括表达钙调节蛋白和SM-MHC的人平滑肌细胞(hSMC)的细胞群的方法。本发明还涉及作为被设计成用于人的治疗成分的组合物，所述组合物包括可通过所述方法获得的分离的平滑肌细胞。本发明还涉及分离的平滑肌细胞在制备被设计成用于替换平滑肌细胞的治疗组合物中的用途。尤其是，本发明涉及所述分离的平滑肌细胞在治疗缺血、癌症或需要损伤组织血管再生的任意疾病中的用途。最后，本发明涉及所述平滑肌细胞作为有效成分的载体在制备被设计成用于需要采用所述活性成分治疗的人的治疗组合物中的用途。

存在于血管、肠和膀胱中的平滑肌细胞(SMC)和骨骼肌细胞(SkMC)为有机体实现机械收缩功能所采用的两种细胞类型。SMC的起源复杂，且取决于它们的位置。实际上，胚胎发生过程中，SMC前体起源于三个系：间质细胞、神经褶细胞或来自心外膜的细胞。最近观察到在外周血循环中存在SMC前体。实际上，用于研究(i)血管新生内膜形成、(ii)动脉移植结果或动脉粥样硬化斑块形成所采用的不同动物模型使得可能表明包含在骨髓细胞中的前体参与这些过程并分化成为SMC。

成年人中，通过卫星细胞群进行骨骼肌细胞修复，单核肌原细胞位于肌纤维基底层的下面。但看起来这个细胞群是异质的。另外，当采用它们释放烟酸己可碱染料的特性(1，2)通过流式细胞术从骨骼肌分离的其他多能细胞被移植到通过照射损坏骨髓的小鼠中(2)时，它们能分化成所有的血液细胞。这个细胞群称为“边群”(SP)。通过表达标志物Scal来确定。然而，它不表达CD34、ckit和CD45。在适合的培养条件下，这些细胞能分化成为结蛋白+的肌细胞(1)。其他研究描述了骨骼肌中存在高细胞“可塑”性的前体细胞(3)。这种骨骼肌似乎包含几种类型的具有不同多能干细胞。

确定这些干细胞的分化特性和它们在培养基中的调节使得在治疗、特别是修复治疗中可能采用这些容易分离的细胞。随后可移植离体培养的这些细胞，它们组成用于自体治疗血管病理(缺血后血管再形成、动脉粥样硬化、肿瘤血管的稳定化、......)的细胞治疗产物。

采用涉及存在VEGF的情况下共培养SkMC与膀胱SMC的方法，Hwang JH.等人已描述了大鼠SkMS的分化(4)，这个方法使得可能获得表达αSMA的分化的SkMC。

WO 03/027281号公开的国际专利申请(Sakurada Kazuhiro et al.)也有记载，它描述了获得起源于骨骼肌间质组织的多能干细胞群，所述多能干细胞群能分化成为神经元、神经胶质细胞、心肌细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞、血细胞、骨细胞、软骨细胞、胰腺细胞和肝细胞。

WO 01/94555号公开的国际专利申请(J.P.Marolleau et al.)也有记载，它描述了肌肉起源的特征细胞群的获得方法及它们的用途。该文件尤其描述了从肌肉组织活检中获得细胞群(其主要细胞类型表达CD56标志物和I型HLA标志物)的方法和制备用于人的细胞治疗产物(特别是为了加强心力衰竭药理治疗的移植物)的方法。

因此期望有一种体外获得主要包括平滑肌细胞(SMC)的细胞群的方法，特别是从采用所述细胞群治疗的个体或患者的肌肉组织样品中获得。

这正是本发明的目的。

因此，本发明第一方面涉及从人肌活检样品或从体外分化成为骨骼肌细胞(hSkMC)的人肌活检样品中体外获得主要包括表达钙调节蛋白和平滑肌肌球蛋白重链(以下称为SM-MHC)的人平滑肌细胞(hSMC)的细胞群的方法，

-所述人肌活检细胞不表达CD31和CD14，以及如果适合，不表达B和T淋巴细胞标志物，和

-所述hSkMC表达CD56、结蛋白和选自MyoD、Myf5和肌形成蛋白基因的肌形成基因并能产生多核肌管，

特征为：包括如下步骤：

A)在包含VEGF(血管内皮生长因子)、优选人VEGF的培养基中培养所述成肌细胞的人肌活检细胞，优选在没有膀胱SMC的情况下进行所述培养；和

B)回收步骤A获得的hSMC。

在“主要包括人平滑肌细胞(hSMC)”的表述中所采用的术语“主要”在本文理解为特别指对于获得的全部细胞群含有至少50％、优选至少60％、70％、75％和80％hSMC的细胞群。

优选地，本发明方法的特征为：表达CD56和结蛋白的所述hSkMC表达MyoD、Myf5和肌形成蛋白基因。

优选地，本发明方法的特征为：所述hSkMC不表达CD34和CD14。