[发明专利]表达用于制备疫苗的乙型肝炎病毒表面抗原

说明书

将本文引用的所有文献以全文纳入本文作参考。

技术领域

本发明属于蛋白质表达领域，具体说，表达用于制备疫苗的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。

背景技术

乙型肝炎疫苗已经使用了许多年(参见例如参考文献1的第16章)，其活性成分是乙型肝炎病毒(HBV)的表面抗原(HBsAg)。最初的HBV疫苗采用从人血中纯化的HBsAg，但在20世纪90年代开始广泛采用基于重组表达的HBsAg的疫苗。从那时起，HBsAg也作为多价疫苗(即含有来自一种以上病原体的免疫原的混合物的疫苗)的组分掺入其中，以便在给予疫苗的同时用一种以上病原体免疫对象。这些多价疫苗一般包含HBsAg和至少′DTP′(白喉、破伤风和百日咳)抗原。

最初的单价重组HBV疫苗ENGERIX B^TM包含氢氧化铝佐剂。近年来，已经出现基于更现代的佐剂的单价HBV疫苗，例如采用′AS04′佐剂[2]的GSK的FENDRIX^TM产品，采用RC-529佐剂的Berna Biotech的SUPERV AX^TM产品，或来自ColeyPharmaceuticals的CpG寡核苷酸佐剂如CPG7909[3]。

在HBsAg的重组表达中，描述了各种系统。已经采用的表达宿主包括细菌、酵母(包括酿酒酵母(Saccharomyces)、汉逊酵母(Hanensula)和毕赤酵母(Pichia))、哺乳动物细胞培养物(包括CHO细胞、COS细胞、Bu3细胞)、昆虫细胞(采用杆状病毒载体)和植物细胞(如′可食用疫苗′)。

本发明的目的是提供其它改进的HBsAg重组表达系统，具体用于制备组合疫苗(如含有DTP抗原的疫苗)或新型单价HBV疫苗所用的HBsAg。

发明内容

重组HBsAg表达的早期报道集中于大肠杆菌(E.coli)[4-6]、小鼠细胞[7]、人细胞[8]、猴细胞[9]和酵母[10-12]。然而近年来，在重组植物中表达引起了广泛关注[13-24]，在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)[25，26]和多形汉逊酵母(Hanensulapolymorpha)[27，28]中的表达也一样。

尽管向这些现代表达系统靠近，但本发明在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主中表达HBsAg。采用基于酵母表达HBsAg时有各种选择，包括选择酵母种类和菌株、培养条件、用于控制表达的启动子、基因终止序列、密码子使用等。按照本发明，在携带含有HBsAg编码序列的质粒的酿酒酵母宿主中表达HBsAg，其中所述质粒包含：(1)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的上游启动子，用于控制HBsAg编码序列的表达；和(2)位于HBsAg编码序列下游的ARG3转录终止子。所述质粒一般也含有：(3)LEU2选择标记物；(4)2μ质粒序列；和(5)在大肠杆菌(Escherichia coli)中有功能的复制起点。

可以在此种酿酒酵母宿主中表达HBsAg，并可将其纯化用于生产疫苗，具体是生产组合疫苗和新型单价HBV疫苗。这种酵母表达材料适用于这些复合疫苗，尽管参考文献29的报道称酿酒酵母-表达的HBsAg可能具有免疫抑制潜能。

多价疫苗

因此，本发明提供了一种制备多价免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在本发明的酿酒酵母宿主中表达后纯化HBsAg，从而制备HBV组件；(b)制备至少一种非HBV组件；和(c)混合所述HBV和非HBV组件，得到所述多价组合物。

本发明也提供了一种多价免疫原性组合物，其包含：(a)含有本发明酿酒酵母宿主表达的HBsAg的HBV组件；和(b)至少一种非HBV组件。该组合物一般也包含一种或多种佐剂。

这些多价组合物具体可用于同时保护儿童免受HBV和非-HBV病原体的感染。典型的患者是一岁以内的患者，在出生后6-9周接受第一个剂量的组合物。一般还以约6-8周的间隔给予两个或三个剂量。也可采用该组合物完成不同疫苗的初免方案。该组合物也可用作加强剂，如给予1-16岁的儿童。

单价疫苗

本发明也提供了一种制备单价免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在本发明酿酒酵母宿主中表达后纯化HBsAg，从而制备HBV组分；(b)将所述HBsAg与佐剂混合，得到所述免疫原性组合物。该佐剂优选不是氢氧化铝佐剂，更优选不仅为铝盐佐剂。