[发明专利]哺乳动物表达系统

说明书

技术领域

本发明涉及哺乳动物表达系统及使用所述哺乳动物表达系统产生期望蛋白质的方法。

背景技术

近来，随着基因组学及蛋白质组学的进步，大量地克隆及表达重组蛋白质的能力变得越来越重要。纯化高水平蛋白质的能力在用于产生诸如胰岛素等蛋白质医药的人类制药学及生物技术配置方面以及在用以(例如)结晶蛋白质以确定其三维结构的基础研究配置方面十分重要。另外难以大量获得的蛋白质可能会在宿主细胞中超表达且随后分离并纯化之。

细菌表达系统已成为一种重组蛋白表达及纯化的方法。然而，许多真核多肽及(尤其是)哺乳动物蛋白质在细菌细胞中的表达经常会产生令人失望及不满意的结果，这是因为所述宿主细胞的条件及环境不利于矫正所述真核蛋白的折叠及修饰。

酵母菌表达系统可为某些真核蛋白的产生提供某些优势，这是因为所述酵母菌表达系统具有分泌途径并能够实施某些受限的转译后修饰。然而，酵母菌系统通常会导致二硫键链接的蛋白质不适当地折叠并可产生低糖基化。

哺乳动物细胞在蛋白质的产生中的使用具有如下重要的优点：提供适度的蛋白质折叠以及适当的转译后修饰，例如，糖基化。然而，许多哺乳动物表达系统不可产生大量的期望蛋白质。

发明内容

本发明涉及肝素、肝素样分子或纤维母细胞生长因子受体(FGFR)促效剂在增加哺乳动物宿主细胞产生蛋白质方面的用途。本发明还涉及组成型活性FGFR或其下游效应子在刺激哺乳动物宿主细胞产生蛋白质方面的用途。

一方面，本发明提供具有改良蛋白质产率的哺乳动物表达系统。这些表达系统包括在含有有效量肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖的培养基中培养的基因工程哺乳动物细胞。所述基因工程宿主细胞各自包含编码相关蛋白质的重组表达盒。肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖在培养基中的存在可大大地增加所述相关蛋白质的产率。

本发明所用肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖的数量可为任一有效地促进培养宿主细胞产生蛋白质的数量。在一个实施例中，本发明所用培养基包括自约1至约1,000微克/毫升的肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖。在另一实施例中，本发明所用培养基包括自约10至约200微克/毫升的肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖(例如，约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100微克/毫升)。

在又一实施例中，本发明所用培养基是用于增加培养宿主细胞产生蛋白质的不含血清培养基，其包含有效量的纤维母细胞生长因子2(FGF-2)或其它FGF与肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖的组合。在许多实例中，所述培养基包括但不限于自约10至约500纳克/毫升的FGF-2(例如，约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500纳克/毫升)。

在另一方面中，本发明的哺乳动物表达系统包括在含有有效量FGFR-1活化剂的培养基中培养的基因工程哺乳动物细胞。这些基因工程细胞各自包含编码相关蛋白质的重组表达盒。FGFR-1活化剂在所述培养基中的存在可显著地增加相关蛋白质的产率。适用于本发明的FGFR-1活化剂的实例包括但不限于FGF、肝素、硫酸肝素葡糖胺聚糖、或其它肝素样分子。也可以使用能够活化其它FGFR的药剂。在一个实施例中，本发明所用FGFR-1活化剂包括肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖及FGF-2二者。

在再一方面中，本发明的哺乳动物表达系统包括基因工程哺乳动物细胞，其各自包含一个或多个编码FGFR-1-介导的信号转导途径的组成型活性组份及相关蛋白质的重组表达盒。在一个实例中，FGFR-1-介导的信号转导途径的组成型活性组份是组成型活性FGFR-1蛋白质。

本发明还涉及β-木糖苷或其它葡糖胺聚糖生物合成诱导剂在改良哺乳动物细胞产生蛋白质方面的使用。适用于此目的的β-木糖苷的非限制性实例包括4-甲基伞形酮基-β-D-木糖苷、p-硝基苯基-β-D-木糖苷及苄基-β-D-木糖苷。在一个实例中，哺乳动物宿主细胞是在包含自约50或约100微克/毫升的4-甲基伞形酮基-β-D-木糖苷的培养基中培养。β-木糖苷的使用可大大地增加哺乳动物宿主细胞的蛋白质产率。