[发明专利]高杀菌活力T4溶菌酶在酵母中的表达及生产方法

说明书

本发明涉及在酵母中表达和生产具备高杀菌活力T4溶菌酶重组蛋白的方法，其中包括使用密码子得到优化的、且蛋白N端第6氨基酸被突变为赖氨酸的T4溶菌酶基因以及特定的酵母发酵培养生长条件，该溶菌酶不仅对多种格兰氏阳性和阴性细菌都有很强的杀菌活性，而且对某些病原真菌和病毒也可能具有一定的抗性，因此可广泛地应用在医药、食品、农业和化妆品等行业。

溶菌酶(lysozyme)是由A.Fleming在1922年首次发现的，它是一种专门作用于细菌细胞壁的水解酶，故又被称细胞壁溶解酶。溶菌酶是一种很有效的广谱性抗菌剂，最初的研究认为，溶菌酶能作用于肽聚糖中的N-乙酰葡萄糖胺以及N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键，而由于胞壁中的肽聚糖支架受到破坏，最后在内部渗透压的作用下使细胞胀裂开，从而引起细菌细胞的死亡。但近来的研究却发现，溶菌酶的抗菌活性并不是因为其能够溶解细菌的细胞壁，而主要是由于在其蛋白分子内部存在一个或多个双亲性的蛋白螺旋结构域，它们可以刺穿细菌的细胞膜，并最终造成细菌的正常生理代谢发生紊乱直至死亡。在溶菌酶蛋白分子经高温变性后，虽然其水解细菌细胞壁的能力完全丧失，但由于位于分子内部的双亲性蛋白螺旋结构域被暴露在外部，其抗菌能力反而更强了，例如，有人将T4溶菌酶N端的第6氨基酸残基由甲硫氨酸改变为赖氨酸后，造成蛋白分子不稳定，杀菌活性反而提高了4倍^[1]。

溶菌酶广泛存在于自然界的动物、植物和微生物当中。例如，在人的白血球、血清、胎盘、唾液、眼泪、奶、子宫黏液和肾脏里都含有溶菌酶(人溶菌酶是一种小分子碱性蛋白，它由单核-巨噬细胞分泌，在人机体中起非特异性的防御作用)，而在番木瓜、凤梨和无花果的鲜汁中也都含有丰富的溶菌酶，据推测，它们也与植物的抗病性有关。

需要特别指出的是，因为人和哺乳动物细胞是没有细胞壁结构的，也不含有肽聚糖成分，故任何来源的溶菌酶对人体和哺乳动物细胞均无毒性作用。

溶菌酶的应用领域包括以下几个方面：

1)溶菌酶可作为防腐剂。它本身是一种蛋白质，且对人和哺乳动物无任何毒性，因此是一种安全性非常高的食品防腐剂。由于溶菌酶仅能作用于目标微生物的细胞壁或细胞膜，而不能作用于其它物质。在使用过程中，除了注意用量外(一般添加0.001-0.01％)，还要掌握食品的pH值、盐浓度、温度以及向食品中添加溶菌酶的时间和适宜的方法。

2)预防龋齿。龋齿是牙科疾病中最常见的一种，主要原因是口腔中存在着一种叫做变异链球菌的细菌，它能把蔗糖转化成为葡萄糖和粘多糖等物质。口腔中的细菌与这些物质粘合在一起，并相互凝聚沉积在牙齿表面，形成牙垢。牙垢细菌在齿垢中厌氧发酵多糖产生多种有机酸，而这些有机酸可从牙齿表面的珐琅质中置换出钙质，从而造成龋齿。若在牙膏、漱口水、口洁剂和口香糖中设法添加一定量的溶菌酶，则可以杀死这些病原细菌，从而达到预防和治疗龋齿的目的。同样，溶菌酶还可以用来制作眼药水和润喉液等。

3)抗生素替代品。临床应用表明，溶菌酶对仔猪腹泻有防治作用，它与免疫球蛋白在功能上有紧密的联系，并能与其他生命活性物质如补体共同作用以增强抗体的活性，从而杀灭细菌。邵春荣等报道称，7-60日龄的仔猪饲喂溶菌酶制剂后，其腹泻发病率显著降低，说明溶菌酶对引起仔猪腹泻的埃希氏大肠杆菌和轮状病毒具有较强的抑制作^[2]。包承玉等经饲喂肉仔鸡、犊牛、仔猪等畜禽证明，溶菌酶可增强动物机体免疫力，用于防治胃肠炎、消化不良等消化道疾病^[3]。研究还发现溶菌酶对引起奶牛乳腺炎的金黄色葡萄球菌、牛化脓棒状杆菌及大肠杆菌等也有较强的抑制作用。

4)在食品、饮料和化妆品中作为添加剂使用。溶菌酶集药理、保健和防腐三个功能于一体，做为一种天然蛋白质无任何毒副作用。例如，食品中若加入溶菌酶，可补充人体内的非特异性免疫因子，杀死肠道内的腐败球菌，维持肠道内菌群正常化，促进双歧杆菌增殖，增强人体的抗感染力。若加入到饮料中，如钙奶、乳酸饮料中，也可起到防蛀牙、爽口的作用。特别是母乳化奶粉，对婴幼儿的成长十分重要。牛奶中的溶菌酶含量极少，而母乳中的溶菌酶含量十分丰富。为弥补奶粉的不足，可以向其中添加适量溶菌酶，制成母乳化能奶粉。溶菌酶的加入，可以加强婴幼儿的抗感染能力。