[发明专利]一种大肠杆菌表达的重组人白介素－11的高效精纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物，具体涉及大肠杆菌表达的重组人白介素—11(rhIL-11)的高效精纯化方法，属于医药技术领域。

背景技术

白介素—11(IL-11)是人体内的一种重要的细胞因子，可与其它细胞因子协同作用刺激人体粒细胞、红细胞、巨核细胞前体细胞的生长，诱导巨核细胞成熟而促进血小板生成。天然的人IL-11由178个氨基酸组成，含有大量的碱性氨基酸如：脯氨酸、亮氨酸等，不含半胱氨酸，缺少二硫键，等电点为11.7，结构稳定。

1997年11月，美国Genetic Institute公司生产的rhIL-11由FDA批准上市，用于治疗癌症患者放、化疗引起的再生性血小板减少症。1998年Genetic Institute公司申请了生产方法专利US5760189，公开了以融合蛋白高效表达重组人白介素—11的方法，但是由于采用专一性的肠肽激酶(enterokinase)对融合蛋白进行切割，价格比较昂贵，大大的增加了生产成本，同时由于引进了异源蛋白，给下游纯化也造成了很大困难。

针对上述技术的不足，专利CN1114617C公开了盐酸羟胺切割融合蛋白的方法，从而解决了上述问题，但是对于rhIL-11的精纯化，该方法采用对融合蛋白羟胺切割液进行透析，然后通过单独琼脂糖凝胶(CM-Sepharose)柱层析，再用0-1mol/LNaCl进行线性梯度洗脱，这种方法存在以下缺陷：透析去除盐酸羟胺时间太长，处理量小，不适合大规模生产；另外国内文献报导有采用亲和层析的方法，此方法虽然专一性强，但载体价格昂贵，机械强度低，配基制备困难，同样存在成本过高的问题；还有采用分子筛层析的方法，这种方法可以得到高纯度的样品，但是装柱柱效要求严格，上样流速、上样量也限制的很低，同样不适合扩大生产。

另外，对于类似于羟胺切割后含高盐、高杂质的蛋白纯化，据相关报道大多采用超滤去除盐酸羟胺及脱盐，再采用单独琼脂糖凝胶(CM-Sepharose)柱层析，通过控制洗脱液的离子强度来控制洗脱组分得到目的蛋白，这样处理的缺点是：超滤的方法造成目的蛋白吸附损失，脱盐液直接上琼脂糖凝胶(CM-Sepharose)柱会造成大量的杂蛋白吸附在柱上，影响了产品的纯度和收率。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种rhIL-11的高效精纯化方法。

实施本发明的前期步骤为现有技术：采用目的蛋白以融合表达方式在大肠杆菌中直接表达和含有羟胺特异切割位点Asn-Gly(天冬酰胺一甘氨酸)的工程菌株PTI 117/DH5α，融合蛋白中的前导肽为大肠杆菌硫氧还原蛋白(thioredoxin)，可引导其后的rhIL-11以可溶状态存在于大肠杆菌的细胞浆中，使rhIL-11具有天然的生物学活性；在其N端甘氨酸前引入了一个盐酸羟胺特异切割位点Asn-Gly(天冬酰胺—甘氨酸)，从而使大肠杆菌表达的融合蛋白可用盐酸羟胺特异切割，以释放完整的rhIL-11蛋白。

本发明的具体步骤包括：

(1)融合蛋白羟胺切割液经过葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐，得切后脱盐液；

(2)脱盐液连续通过阴离子交换层析柱与阳离子交换层析柱串联层析系统，截留未被切开的融合蛋白及杂质；

(3)采用Gly-NaOH(甘氨酸—氢氧化钠)缓冲液对串联层析系统进行平衡，使融合蛋白吸附到阴离子交换层析柱上，目的蛋白吸附到阳离子交换层析柱上；

(4)采用添加了NaCl的Gly-NaOH(甘氨酸—氢氧化钠)缓冲液中对进行了步骤(3)处理后的阳离子交换层析柱进行洗脱，使目的蛋白穿出阳离子交换层析柱，收集洗脱蛋白液；

(5)洗脱蛋白液经过葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐柱脱盐去除Na⁺、Cl^-，得到高纯度的蛋白样品。

经过上述步骤的处理，得到的目标蛋白白介素—11纯度高，一次处理量大，且收率大大提高，为大规模生产提供了技术基础。

上述步骤(2)中的阴离子交换层析柱的层析介质包括琼脂糖凝胶(Sepharose)类、聚苯乙烯(SOURCE)类，配基包括季铵基Q或二乙基氨乙基DEAE。

上述步骤(2)和步骤(4)中的阳离子交换层析柱的层析介质包括琼脂糖凝胶(Sepharose)类、聚苯乙烯(SOURCE)类，配基包括磺甲基S或磺丙基SP或羧甲基CM。

阴阳离子交换层析柱的层析介质能够用氢氧化钠在位清洗消毒，流速高，为生产的准备提供了方便。