[发明专利]重组人甲状旁腺素(1～34肽)的生产方法

权利要求书

1.一种编码重组人甲状旁腺素(1～34肽)的DNA序列，其特征在于，其编码如SEQID NO：2所示的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：1所示的DNA序列有95％的同源性。

2.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA序列。较佳地，所述的表达载体是pThioHisA/PTH。

3.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求2所述的表达载体或权利要求1所述的编码重组人甲状旁腺素(1～34肽)的DNA序列。

4.一种生产重组人甲状旁腺素(1～34肽)的方法，其特征在于，它包括步骤：

a)在适合的表达条件下，培养如权利要求4所述的宿主细胞，从而表达出重组人甲状旁腺素(1～34肽)蛋白；

b)分离纯化出表达的人甲状旁腺素(1～34肽)蛋白。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的宿主细胞是大肠杆菌。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中进行高密度悬浮培养。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤(b)包括步骤：

i)对发酵样品通过离心和/或过滤方式去除上清，获得发酵后菌体；

ii)对发酵沉淀进行压榨破菌、收集压榨上清；

iii)层析纯化，所述的层析选自：阴离子交换层析、金属螯和亲和层析、阳离子交换层析及其组合。

iv)采用肠激酶EK酶切后，经进一步纯化获得目的蛋白。对发酵样品通过离心和/或过滤方式去除上清，获得发酵后菌体；

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的培养条件是：培养温度为30-40℃，更佳地34-38℃；磷酸盐缓冲体系浓度20-200mM，pH5-8；Mg²⁺盐0-5mM；碳源为葡萄糖，是单一碳源，较佳地，葡萄糖浓度为1.0％，补料中葡萄糖浓度为11.25％；添加维生素B1作为补充维生素，浓度1～1000PPM；微量元素可加0.1-2ml/L培液；诱导剂为IPTG浓度在0.1-1mg/L之间，诱导前OD600在0.5～20之间，更佳地在1～10之间；诱导时间0.5～10小时，更佳地1～5小时。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的纯化条件是：先离心获得发酵液后沉淀即菌体。然后压榨破菌经离心获得压榨上清，后经Q-Sepharose F.F.层析、Ni²⁺螯和亲和层析、SP-sepharose F.F.层析、EK酶切、再经SP-Sepharose F.F.层析进一步纯化，获得纯度98％以上的纯品。