[发明专利]一株短小芽孢杆菌及其在生物转化异丁香酚生产天然香兰素中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物转化异丁香酚生产天然香兰素的方法，具体地说，尤其涉及使用一株短小芽孢杆菌生物转化异丁香酚生产天然香兰素的方法。

背景技术

香兰素，化学名为4-羟基-3-甲氧基苯甲醛(4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde)，又名香草醛、香荚兰素。英文名为vanillin，分子式为C₈H₈O₃，分子量为152.14。香兰素外观为白色至微黄色针状结晶或粉末，呈香荚兰豆特有的香气，微甜，在潮湿的空气中缓慢氧化为香兰酸。沸点为284～285℃，相对密度为1.056，微溶于水，易溶于乙醇、乙醚、氯仿、冰醋酸、二硫化碳和吡啶等有机溶剂。香兰素有低微毒性，大白鼠经口LD₅₀为1580毫克/千克。

香兰素是世界上产量最大、用途最广的香料之一，被誉为“香料之王”。香兰素广泛应用于巧克力、冰激凌、糖果等食品以及香烟、饮料和高档化妆品中。它不仅可以用作增香剂和定香剂，还可在食品中用作防腐剂、保鲜剂和抗氧化剂。在化学工业中，香兰素可抑制润滑剂发泡，用作镀锌槽的增白剂、锌电镀的活性剂。香兰素也是重要的医药合成中间体，用作生产L-多巴、L-甲基多巴和罂粟碱的基础原料。目前世界市场上香兰素的需求为每年1.5万吨，且以每年10％的速度增长。

目前常用的香兰素生产方法是植物原料提取法和化学合成法。香兰素是天然香荚兰的主要成分，其在香荚兰豆中的含量约为15～20克/千克。香荚兰在种植过程中需要对花朵进行人工授粉，劳动强度大，难以进行大规模栽种，从植物原料提取不能满足日益增长的天然香兰素市场需求，其年产量仅为2000吨左右。绝大多数的香兰素产品是通过化学合成的，常用的化学合成底物包括丁香酚、木质素、乙醛酸、黄樟素和愈创木酚等。国内常用的是采用愈创木酚和乌洛托品反应的亚硝化工艺，该方法线路长，分离过程复杂，收率低，环境污染严重，原料消耗高，国外早已被淘汰。国外主要采用愈创木酚和乙醛酸缩合工艺，该工艺设备简单，产率较高，但还处于研究阶段，未能应用于工业化生产。总体来说，化学合成法工艺成熟，产物纯度高，原料来源广泛，但存在严重的缺陷，比如环境污染严重，产品香气单一，易掺杂质，合成香兰素的安全性也受到质疑。

随着生活水平的提高，人们对天然绿色产品的需要也越来越高。与化学合成相比，生物法合成香兰素具有反应条件温和，副产物少，提取步骤简单，生产清洁，环境污染低，产品安全可靠等优点，正日益受到人们的重视。包括阿魏酸、木质素、香兰酸、丁香酚和异丁香酚在内的多种天然底物可用做生产香兰素的底物，其中研究得较为深入的是阿魏酸和丁香酚。以阿魏酸为底物生产香兰素，生产周期短，产物收率高，香兰素最终浓度可以达到1％以上。但天然阿魏酸本身就是一种重要的药用原料，价格昂贵，生产成本高。采用阿魏酸酯酶等在温和条件下水解麦麸、米糠和甜菜等植物废料可获得天然阿魏酸，但水解效率很低，产物分离提取困难，难以达到工业化规模生产的要求。

丁香酚和异丁香酚是天然丁香油的主要成分，原料来源广泛，价格低廉，是生物转化法生产天然香兰素的合适底物。通过丁香酚和异丁香酚的生物转化生产香兰素的对比发现，以丁香酚为原料生产香兰素的生产工艺，香兰素终浓度远远低于1克/升，且转化时间一般很长，大部分研究者认为，异丁香酚更适合作为天然香兰素生产的底物。截止到目前为止，文献报道仅有几株芽孢杆菌、黑曲霉、沙雷氏菌和红球菌有转化异丁香酚累积香兰素的能力，但香兰素产率低，达不到工业化生产的要求。Abraham首次报道黑曲霉能转化异丁香酚产生香兰素，但累积的香兰素浓度仅为0.1克/升。Chatterjee使用一株红球菌Rhodococcus rhodochrousMTCC 289转化异丁香酚，香兰素摩尔产率高达58％，但最终香兰素浓度低于1克/升。Furukawa从土壤中筛选到一株转化异丁香酚为香兰素的芽孢杆菌Bacillus sp.B2，使用生长体系转化时香兰素浓度为0.8克/升，使用粗酶液转化时提高到0.9克/升，转化率不到10％。Furukawa筛选到的另外一株恶臭假单胞菌Pseudomonasputida I58有较高的异丁香酚降解活力，在30分钟内能完全降解1.5克/升的异丁香酚，但终产物为香兰酸，不累积香兰素。到目前为止有报道的以异丁香酚为底物通过微生物转化生产香兰素产量最高的是一株粘质沙雷氏菌Serratia marcescens DSM 30126，据报道其香兰素浓度在9天内最高可达3.8克/升，但其缺点是转化时间过长，且转化率很低，仅为20.5％。

发明内容