[发明专利]一种防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品和应用

权利要求书

1.一种防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，该产品可以从以下步骤所获得，首先从贝氏隐孢子虫阳性粪便中收集卵囊进行分离后用蔗糖梯度离心法纯化卵囊，并制备成贝氏隐孢子虫抗原，用贝氏隐孢子虫抗原免疫母产卵禽，然后收集其所产禽卵，再从禽卵中收集蛋黄，以蒸馏水稀释，离心取上清液，经水稀释硫酸铵盐析法纯化得到卵黄免疫球蛋白。

2.根据权利要求1所述的防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，其特征在于：从贝氏隐孢子虫阳性粪便中收集卵囊是指收集阳性畜粪便中卵囊，卵囊呈长卵圆形，测得卵囊大小为6.5μmx4.7μm形状指数1.31，经3日龄鹌鹑盲传清除混有的鸡球虫卵囊。

3.根据权利要求2所述的防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，其特征在于：进行分离是指用饱和蔗糖溶液漂浮法收集卵囊，27％W/V的蔗糖溶液粗提卵囊，以3日龄雏鸡传代扩增，建立动物感染模型及18sRNA序列比对分析，确定为贝氏隐孢子虫。

4.根据权利要求1或3所述的防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，其特征在于：用蔗糖梯度离心法纯化卵囊是指，①配制蔗糖原液：蔗糖500g，蒸馏水320mL溶解后，高压灭菌；②配制PBS缓冲液：NaCl 8.0g，KCl 0 .2g，KH₂PO₄ 0.2g，NaHPO₄·12H₂O 2.9g，蒸馏水1000mL，调PH值7.4后灭菌；③将①蔗糖原液与②PBS缓冲液配制为a、1份蔗糖原液加入1份PBS缓冲液后蔗糖浓度W/W％为30.4称为1∶1蔗糖水；b、1份蔗糖原液加入2份PBS缓冲液后蔗糖浓度W/W％为25称为1∶2蔗糖水；c、1份蔗糖原液加入3份PBS缓冲液后蔗糖浓度W/W％为18.7称为1∶3蔗糖水；d、2份蔗糖原液加入7份PBS缓冲液后蔗糖浓度W/W％为16.8称为1∶3.5蔗糖水；e、1份蔗糖原液加入5份PBS缓冲液后蔗糖浓度W/W％为12.5称为1∶5蔗糖水；④卵囊用10mL直径1.2cm的玻璃离心管提纯，程序如下：a、先加入1∶1蔗糖水2份，再沿玻璃管壁缓慢加1份卵囊悬浮液，3000rmin^-1，10min，以吸管吸出卵囊层，加入2倍体积PBS缓冲液离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中；b、加入1∶2蔗糖水2份，再沿玻璃管壁缓慢加1份a步骤沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中的卵囊悬浮液，3000rmin^-1，10min，以吸管吸出卵囊层悬浮液，加入2倍体积PBS缓冲液离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中；c、加入1∶3蔗糖水2份，再沿玻璃管壁缓慢加1份b步骤沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中的卵囊悬浮液，3000rmin^-1，10min，以吸管吸出卵囊层悬浮液，加入2倍体积PBS缓冲液离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中，再重复一次；d、加入1∶3.5蔗糖水1份，沿管壁加于离心管中，然后沿管壁缓缓加入1∶5蔗糖液1份，最上层加入1∶3蔗糖提取物卵囊悬液1份，3000rmin^-1，10min，回收卵囊层悬浮液；⑤用PBS缓冲液稀释后以5μm滤膜微滤除菌，浓缩后加入终浓度为1000U/mL的双抗，4℃保存。

5.根据权利要求4所述的防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，其特征在于： 制备成贝氏隐孢子虫抗原是指将纯化除菌后的贝氏隐孢子虫卵囊悬浮于PBS缓冲液中10⁸/mL，冰浴超声波80HZ 2min×5次破碎卵囊，再反复冻融5次液氮与水浴37℃，4℃，10,000rmin^-1离心卵囊处理液15min，上清作为检测用抗原，紫外分光光度法测蛋白浓度，-20℃保存备用；沉淀部分加入适量PBS缓冲液，以2倍体积的弗氏完全或非完全佐剂乳化，作为免疫用抗原，乳化好的疫苗4℃保存。